Скачати повний текст

Дисертаційну роботу присвячено вивченню ендофітної мікробіоти судин та тканин пухлин винограду, збудника бактеріального раку, пошуку його активних антагоністів серед молочнокислих бактерій та створенню на їх основі біопрепарату проти збудника бактеріального раку рослин. Встановлено чисельність та видовий склад ендофітної мікробіоти судин винограду, середню чисельність представників мікробіоти та бактерій роду Rhizobium у пухлинах винограду. ПЛРаналіз генів патогенності показав, що у пухлинах рослин переважають авірулентні бактерії R. vitis і R. radiobacter. Було ізольовано та ідентифіковано штами патогенних ризобій R. vitis ONU388, R. vitis ONU389 та R. vitis ONU390. З метою пошуку штамів антагоністів проти збудників бактеріального раку винограду серед штамів Lactobacillus plantarum ПЛР-дослідження показало, що усі досліджені штами L. plantarum містять від 2 до 6 генів, відповідальних за синтез плантарицинів, що вказує на рівень їх антагоністичного потенціалу. Дослідження антагоністичної активності лактобацил in vitro проти збудниківбактеріального раку рослин показало, що у 100% випадків ризобії пригнічувалися внаслідок утворення органічних кислот досліджених штамів (pH 3,5-4,0) та лише бактерії L. plantarum ONU87 є продуцентом бактеріоцину. Дослідження in vivo на моделі дисків моркви у випадку обробки ризобіями з бактеріями досліджуваних штамів L. plantarum показало, що серед семи протестованих штамів L. plantarum найкращі результати пригнічення росту пухлин показали шість штамів лактобацил, що свідчить про високу антагоністичну активність цих лактобактерій відносно ризобій. За ступенем антагоністичної активності, пригнічення утворення, росту пухлин і спектром генів, що відповідають за синтез бактеріоцинів, для подальших досліджень було відібрано перспективний штам L. plantarum ONU87.Методом математичного аналізу з використанням неповної регресійної моделі розроблено оптимальне поживне середовище, що дає можливість отримати концентрацію життєздатних клітин бактерій 1,16х1010 КУО/мл. Розроблено технологічну схему отримання біопрепарату та рекомендації стосовно умов та термінів зберігання біопрепарату. Встановлено, що обробка бактеріями L. plantarum ONU87 рідкої форми біопрепарату за штучного інфікування чубуків винограду R. radiobacter C58 призводила до зменшення на 76,8% кількості заражених зразків, в які потрапив збудник бактеріального раку та стимулювала ріст і розвиток рослин винограду.^UThe dissertation is devoted to the study of endophytic microbiota of vessels and tissues of the crown gall of grapes, the search for active antagonists among lactic acid bacteria and to the development of the biological formulation based on lactic acid bacteria for prevention of the crown-gall disease in plants. The quantitative and qualitative composition of the endophytic microbiota of grapes and crown gall tissues was determined. PCR analysis of pathogenicity genes demonstrated that avirulent bacteria Rhizobium vitis and Rhizobium radiobacter predominated in crown galls. Pathogenic strains R. vitis ONU388, R. vitis ONU389 and R. vitis ONU390 were isolated. In the search of antagonistic strains against bacteria causing crown-gall disease in plants, all of the studied strains of Lactobacillus plantarum were found to contain from 2 to 6 genes which code for the synthesis of plantaricins. This correlates with the level of their antagonistic potential. An in vitro study of the antagonistic activity oflactobacilli against pathogenic bacteria causing the crown-gall disease demonstrated that 100% of rhizobia growth was inhibited by the lactobacilli synthesising organic acids (pH 3.5-4.0). However, only L. plantarum ONU87 produced a bacteriocin active against gram-negative rhizobia. The in vivo study based on the carrot discs model co-inoculation with rhizobia and the studied strains of L. plantarum demonstrated that among seven tested strains of L. plantarum the best results for tumor growth inhibition were shown by six strains of lactobacilli, suggesting high antagonistic activity of the mentioned lactobacteria. According to the degree of antagonistic activity, inhibition of tumor formationand the present spectrum of genes which code for bacteriocins, a promising strain of L. plantarum ONU87 was selected for further studies.The method of mathematical analysis based on the partial regression model was used to develop the optimal culture medium composition. With this medium the concentration of lactic acid bacteria in the stationary phase of growth increased to 3,51±0,103 ×1010 CFU/ml. A biotechnological production plan for the biological formulation was developed and the recommendations for storage were provided.It was established that treatment of grape shoots artificially infected by R. radiobacter C58 with the L. plantarum ONU87 strain reduced the amount of infected samples by 76,8% and stimulated growth and development of grapes.

Робота присвячена характеристиці штаму Enterococcus italicus ОНУ547, який є здатним продукувати бактеріоцин, а також вивченню властивостей самого бактеріоцину. Вивчено тинкторіальні, морфологічні, культуральні, біохімічні, фізіолого-біохімічні та генетичні особливості бактерій виділеного штаму продуценту бактеріоцину та ідентифікованого його як належного до виду E. italicus. Визначено, що до складу клітин E. italicus ОНУ547 входять в найбільшій кількості L-глутамінова кислота (12,68%), L-аргінін (16,58%) та гліцин (16,47%) серед амінокислот та глюкоза (87,77%) серед цукрів. Виявлено присутність оцтової кислоти в культуральній рідині E. italicus ОНУ547. Охарактеризовано бактеріоцин E. italicus ОНУ547 та встановлено його гідрофобність, катіонну природу, двох компонентну структуру (або наявні два різних бактеріоцини), термостабільність, інгібувальну активність проти бактерій, що спричиняють псування харчових продуктів, умовно-патогенних бактерій, а також їх біоплівок. Показано продукцію нового бактеріоцину для виду E. italicus. Встановлено здатність бактерій штаму E. italicus ОНУ547 пригнічувати ріст фітопатогенних бактерій R. radiobacter C58 та Erwinia carotovora ZM1 in vivo та, крім того, утворювати біоплівки на поверхні рослин. Ці дві останні властивості вони проявляли як окремо, так і в комплексах з бактеріями Lactobacillus plantarum ОНУ12 та Lactobacillus plantarum ОНУ311.^UThe work is dedicated to characterization of the strain Enterococcus italicus ОNU547, which is able to produce a bacteriocin and also to study of properties of the bacteriocin. Tinctorial, morphological, cultural, biochemical, physiological biochemical and genetic properties of bacteria of the isolated strain of bacteriocin producer were studied and it was identified as belonging to the species E. italicus. It was determined that L-glutamic acid (12,68%), L-arginin (16,56%) and glycine (16,47%) compose cells of E. italicus ONU547 in the biggest quantity among amino acids and glucose (87,77%) - among sugars. Presence of acetic acid in cultural liquid of E. italicus ONU547 was revealed. Bacteriocin of E. italicus ONU547 was characterized and its hydrophobicity, cationic nature, two component structure (or there are two bacteriocins), thermostability, inhibitory activity against bacteria causing food spoilage, opportunistic bacteria, and also their biofilms were established. Production of new bacteriocin for the species E. italicus was showed. Ability of bacteria of the strain E. italicus ONU547 to inhibit growth of phytopathogenic bacteria Rhizobium radiobacter C58 and Erwinia carotovora ZM1 in vivo and, moreover, to form biofilms on plant surfaces were established. These last two properties they exhibit as separately as well as in complexes with bacteria Lactobacillus plantarum ОNU12 and Lactobacillus plantarum ОNU311.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню біологічної різноманітності та біологічних характеристик аеробних споротвірних бактерій глибоководних донних відкладень Чорного моря та визначенню їх потенціалу щодо продукції антимікробних сполук. В результаті досліджень в глибоководних осадах Чорного моря з екстремальними анаеробними умовами відкрито аеробні споротвірні бактерії, охарактеризовано їх біологічну різноманітність, а також біологічні властивості, структуру геномів, метаболомів та спектри антимікробних сполук антагоністично активних штамів. Вперше з донних відкладень Чорного моря виділено ізоляти споротвірних бактерій, які методом аналізу профілів жирних кислот віднесено до 14 видів та охарактеризовані за антагоністичною активністю по відношенню до опортуністичних патогенів людини і тварин. За результатами скрінингу відібрано 3 штами, ідентифіковані методами молекулярної філогенетики та порівняльної геноміки як B. velezensis ONU 553, B. pumilus ONU 554 та B. subtilis ONU 559, з найбільш високим рівнем антагоністичної активності. З використанням біоінформатичних інструментів вперше ідентифіковано біосинтетичні кластери ліпопептидів групи сурфактинів підгрупи пумілацидинів та гагеотетрину з групи сурфактинів, амікумацинового антибіотику АІ-77 та зроблено припущення про виявлення біосинтетичного кластеру пентапептиду GPFPI. Дані про інші сполуки, ідентифіковані для бацил вперше, потребують подальшої веріфікації. Отримані дані поповнюють знання про біосинтетичний потенціал морських бацил. Серед вторинних метаболітів досліджуваних штамів виявлено варіанти найбільш вивченого класу нерибосомних пептидів – сурфактинів (антеізо-C16-сурфактин, сурфактин B2 1-Me естер), гагеостатинів, фенгіцинів та амікумацинів, а також секретований пентапептид зі здатністю до інгібування протеаз GPFPI. Дані про інші сполуки, ідентифіковані для бацил вперше, потребують подальшої верифікації. Практичне значення отриманих результатів роботи полягає у поповненні Колекції морських бактерій Одеського національного університету імені І. І. Мечникова новими штамами, а отримані дані щодо геномів та екзометаболомів досліджених штамів можуть слугувати науковою основою для розробки на їх основі продуцентів нових для промисловості сполук та пробіотичних препаратів.^UThe dissertation is devoted to the study of biological diversity and biological characteristics of aerobic sporeforming bacteria of deep-water bottom sediments of the Black Sea and the determination of their potential regarding the production of antimicrobial compounds.As a result of research in deep-water sediments of the Black Sea with extreme anaerobic conditions, aerobic sporeforming bacteria were discovered, their biological diversity was characterized, as well as biological properties, genome structure, metabolomes and spectra of antimicrobial compounds of antagonistically active strains. For the first time isolates of spore-forming bacteria were isolated from thebottom sediments of the Black Sea, which by the fatty acid spectra analysis were assigned to 14 species and were characterized by antagonistic activity to the opportunistic pathogens of humans and animals. According to the results of screening of antagonistically active bacteria, 3 strains were selected and were identified by the methods of molecular phylogenetics and comparative genomics as Bacillus velezensis ONU 553, Bacillus pumilus ONU 554 and Bacillus subtilis ONU 559, as such with the highest activity. Among the secondary metabolites of the studiedstrains, variants of the most studied class of non-ribosomal peptides - surfactins (anteiso-C16-surfactin, surfactin B2 1-Me ester), gageostatins, fengycins, and amicoumacins, as well as a secreted pentapeptide with the ability to inhibit proteases GPFPI. Data on other compounds identified for bacilli for the first time require further verification. The practical significance of the obtained results consists of the replenishment of the Collection of the sea and useful microorganisms of Odesa I. I. Mechnikov National University with new strains of marine bacteria, as well asdata on studies of genomes and exometabolomes of antagonistically active strains could be a scientific basis for the development of their base producers of new compounds for industry and probiotic preparations.