Дисертація присвячена оптимізації культивування мезенхімальних стовбурових клітин Вартонова студня людини (МСК-ВС), шляхом застосування умов фізіологічних концентрацій кисню, та дослідженню впливу цих умов на життєдіяльність МСК-ВС. У результаті роботи розроблено схеми створення сумішей зі зниженим вмістом кисню, на основі аргону та азоту. Виявлено, що введення МСК-ВС у культуру методом експлантів за фізіологічних концентрацій кисню (3%) сприяє підвищенню кількості отриманих клітин, незалежно від особливостей тканини Вартонова студня. Встановлено, що кількість МСК-ВС, отриманих при 3% кисню, була на 28% більшою, порівняно зі стандартними умовами СО2-інкубатора. Дослідження метаболічної активності у первинних культрах виявили значну гетерогенність між популяціями, отриманими від різних донорів. Інтенсивність утворення формазану в МТТ-тесті, в середньому, була на 35% вищою при 3% кисню, ніж в умовах СО2-інкубатора, що відповідало більшій кількості клітин.Встановлено, що культивування при 3% кисню підвищує рівень проліферації МСК-ВС на всіх досліджених пасажах і не впливає на рівень експресії поверхневих маркерних білків. Також, було розроблено метод отримання культур МСК-ВС шляхом відбору клітин, які спонтанно відкріпились, з кондиціонованого середовища, та їхньої подальшої мультиплікації. Було встановлено, що характер проліферації у «побічних» культурах МСК-ВС, отриманих згаданим способом з нульового і першого пасажів, в стандартних умовах СО2-інкубатора, загалом відповідав притаманному «основній» культурі, тоді як рівень проліферації «побічних» популяцій, отриманих з культур на другому пасажі, був суттєво нижчим. Для культур МСК-ВС "основної" та «побічних» ліній на 3 і 4 пасажах, отриманих з нульового та першого пасажів, кількість клітин з фенотипом, притаманним старіючим, була практично однаковою тоді у "побічній" лінії, отриманої з другого пасажу, була помітно більшою. Порівняння ефективності культивування МСК-ВС, отриманих згаданим методом, у газових сумішах на основі азоту та аргону, які містили 3% кисню показало, що кількість МСК-ВС в умовах помірної гіпоксії в усіх варіантах була вищою, ніж в стандартних умовах СО2-інкубатора.На всіх досліджених пасажах МСК-ВС, культивовані в газових сумішах з 3% кисню, були більш гомогенними за морфологією та містили меншу кількість клітин з фенотипом, типовим для старіючих, у порівнянні з культурами з умов СО2-інкубатора. Для всіх груп найвищий рівень морфологічної гомогенності можна було спостерігати на другому пасажі. В суміші на основі азоту культури були найбільш гомогенними і містили найменшу кількість МСК-ВС з фенотипом, притаманним старіючим клітинам. Показано значну гетерогенність у активності асоційованої зі старінням бета-галактозидази. У групах, культивованих при 3% кисню в суміші на основі азоту, цей показник був найнижчим.Вперше встановлено, що культивування та проведення процедури трансфікування МСК-ВС невірусними методами, за допомогою нанорозмірних поліплексів, у газових сумішах зі зниженим вмістом кисню (3%) сприяє підвищенню ефективності трансфекції. Відсоток процент МСК, які експресували маркерний білок, був більшим в середньому у 2,58 в суміші на основі азоту, та 1,37 рази в суміші на основі аргону.Розроблені в результаті роботи оптимізації мають позитивний вплив на життєдіяльність МСК-ВС в умовах in vitro. Вперше виявлено наявність різниці у ефектах газових сумішей, створених на основі азоту і на основі аргону.^UThe present PhD thesis is dedicated to the study of cultivation of mesenchymal sem cells from Wharton jelly (WJ-MSC) under physiologic oxygen concentrations. In present work, two systems for composing the gas mixtures with low oxygen concentrations, based either on nitrogen or argon, were developed and tested for cultivation of WJ-MSC. The obtaining of WJ-MSC primary cultures by explant method in gas mixtures with 3% oxygen showed, that the number and size of WJ-MSC colonies were higher under conditions of mild hypoxia, comparing to standard CO2-incubator conditions. On average, the number of WJ-MSC in conditions of mild hypoxia was 1,27 fold higher. The study of metabolic activity of primary WJ-MSC cultures showed the high level of heterogeneity between populations, obtained from different donors. On average, the optical density in MTT-test was 1,35 fold higher under 3% oxygen, comparing to standard CO2-incubator conditions.The study of WJ-MSC proliferative activity in gas mixtures, containing 3% oxygen, based either on nitrogen or argon, showed, that after 7 days of cultivation, at passages 1 to 5, the numbers of cells in WJ-MSC cultures maintained in 3% oxygen gas mixtures were larger, than in control group from standard CO2-incubator conditions, even after slight decrease in proliferative activity after passage 3. No changes in MSC surface marker proteins were detected. We also developed the method of multiplication of WJ-MSC, spontaneously detached from substrate, presumably, before or during cell division. The study revealed that the proliferative activity in "side lines", obtained from spontaneously detached cells (SDC) at passage 0 and 1, was nearly similar to one of cultures, passed with trypsin-EDTA solution. The proliferation level in cultures, obtained from SDC collected on passage 2, appeared to be significantly lower, than that in the trypsin-EDTA passed line. We also found, that WJ-MSC cultures of "main" and "side" lines from 0 and 1 passage, contained similar numbers of cells with senescent phenotype at passage 3 and 4, while their numbers in "side line" from passage 2 was significantly higher. The study showed, that under 3% oxygen, the number of MSC-WJ in cultures, obtained from SDC, was higher comparing to the standard CO2 incubator conditions.The analysis of WJ-MSC morphology revealed, that the degree of heterogeneity in nuclear-cytoplasmic ratio and “width\length ratio” in cultures, changed during cultivation period. For all groups, the highest level of homogeneity was observed at passage 2. Comparing the effects of gas mixtures, the highest level of homogeneity was observed in nitrogen-based gas mixtures. We also showed the heterogeneity in the activity of senescence-associated -β-galactosidase at passage 3 in all conditions. The lowest level of SA-β-gal activity was detected in nitrogen-based gas mixture. We also showed that the number of SA-β-gal was on average, greater, than the number of cells with flattened shape. In this study, the novel optimization for methods of non-viral WJ-MSC transfection was developed, by conducting all the stages of transfection procedure under physiological oxygen tensions. The transfection with nano-sized polyplexes containing plasmid DNA with marker gene (enhanced green fluorescent protein - eGFP), in gas mixtures with 3% oxygen, showed, that the percent of eGFP-positive cells was significantly higher under mild hypoxia, than in control group, maintained in standard CO2-incubator conditions. In general, the number of eGFP-positive cells was 2,58-time higher in nitrogen-based mixture, and 1,37 in argon-based mixture, comparing to CO2-incubator conditions.The present work showed the positive effect of mild hypoxic conditions on WJ-MSC cultures and is the first to reveal the difference in biological effects of gas mixtures, with nitrogen and argon as "base" component, on WJ-MSC.

Дисертаційна робота присвячена розробці підходів до посилення імуногенності рекомбінантних плазмідних конструкцій, які містять химерний ген Е2 глікопротеїна віруса класичної чуми свиней, шляхом оптимізації складу модельної маркованої ДНК-вакцини. В ході виконання роботи було створено серію рекомбінантних плазмід, які містять химерні гени на основі SacI-EcoRI фрагменту Е2 віруса класичної чуми свиней під транскрипційним контролем промотору/енхансеру ранніх генів цитомегаловірусу людини у складі евкаріотичної еспресійної касети, що розташована між інвертованими термінальними повторами адено-асоційованого вірусу -2 людини (ITR AAV-2). В транзиторній системі експресії показано, що введення до складу рекомбінатного вектору послідовностей ITR AAV-2 призводить до збільшення накопичення химерного антигену на основі Е2 ВКЧС в трансфікованих клітинах лінії НЕК293. Так для клітин лінії НЕК293, які були трансфіковані pTR-EGFP/E2 на третю добу після трансфекції показано експресію химерного EGFP/E2 на рівні ~ 113 ± 21 нг/105 кл/72 год, в той час як для клітин, трансфікованих плазмідою pEGFP/E2 - ~ 15 ± 3.7 нг/105 кл/72 год. Варто зауважити, що різниця рівнів експресії химерного білка EGFP/E2, що спостерігалася при трансфекції клітин лінії НЕК293 плазмідами pTR-EGFP/E2 та pEGFP-E2, не була наслідком пригнічення метаболічної активності клітин за рахунок більшої цитотоксичності препаратів ДНК/ПЕІ, чи цитотоксичного впливу експресії химерного протеїну. Продемонстровано, що введення ITR AAV-2 у плазмідний вектор не впливало суттєво на тривалість експресії та персистенції трансгену у клітинах НЕК293 за умови відсутності селективного тиску. Виявлено, що створені рекомбінантні плазмідні конструкції pTR-BKneo- та pBS-BK здатні індукувати продукцію специфічних до фрагменту Е2 ВКЧС антитіл у мишей. Вперше продемонстровано, що введення до складу векторної конструкції модельної маркованої ДНК-вакцини проти КЧС послідовностей ITR AAV-2 призводить до збільшення як інтенсивності, так і тривалості гуморальної імунної відповіді на імунізацію. Відомо, що застосування гетерологічної бустерної вакцинації може значно посилити імуногенність кандидатних вакцинних препаратів, а також дозволить знизити їх реактогенність та ймовірність розвитку імунної відповіді на вектор. Отримані нами дані свідчать по те, що бустерна імунізація фрагментом рекомбінантного білку Е2 ВКЧС після дворазової імунізації плазмідним вектором pTR-BKneo- призводить до значного посилення синтезу антитіл до цільового антигену порівняно з триразовим введенням pTR-BKneo-. Однією з перспективних стратегій посилення імунної відповіді на ДНК-вакцинацію, яка розглядається останнім часом, є введення до складу вакцинного препарату так званих «генних ад'ювантів» - рекомбінантних векторів, які несуть гени цитокінів, хемокінів чи ко-стимуляторних молекул. В рамках цієї роботи ми створили рекомбінантні конструкції pmIL12-TR та pmIL2-TR, які містять гени інтерлейкіну-12 та інтерлейкіну-2 миші відповідно, під транскрипційним контролем промотору/енхансеру ранніх генів цитомегаловірусу людини у складі експресійної касети розташованої між ІТR ААV-2. А також їх похідні pTR-mIL2/EGFP та pTR-mIL2/EGFP, які містять ген химерного білка IL2/EGFP та IL12/EGFP відповідно. Дослідження функціональної активності створених векторів in vitro продемонструвало, що химерні білки експресуються зі створених рекомбінантних конструкцій у клітинах лінії НЕК293, та частково секретуються з клітин у культиваційне середовище. В дослідах in vivo було доведено, що комбіноване введення pTR-BKneo- та генів інтерлейкіну-2 та химерного інтерлейкіну-12 миші у складі створених рекомбінантних конструкцій посилює гуморальну імунну відповідь на Е2 ВКЧС. Показано, що ефект посилення найбільш виражений у групі тварин, якім вводили по 10 мкг pmIL12-TR та pmIL2-TR у комбінації з pTR-BKneo-.^UThe thesis is devoted to developing approaches to enhance the immunogenicity of recombinant plasmid constructs containing the chimeric gene for the E2 glycoprotein of classical swine fever virus by optimizing the composition of model marker DNA vaccine. A series of recombinant plasmids was created, containing chimeric genes based on the SacI-EcoRI fragment of the E2 fragment of classical swine fever virus, placed under the transcriptional control of the promoter/enhancer of early/immediate genes of human cytomegalovirus in the eukaryotic cassette, and located between inverted terminal repeats of human adeno-associated virus-2 (ITR AAV-2). In a transient expression system, it was demonstrated that the introduction of ITR AAV-2 sequences into the recombinant vector leads to an increase in the accumulation of chimeric antigen in transfected cells of the HEK293 line. The amount of EGFP/E2 in the cells transfected with plasmid pTR-EGFP/E2 was ~113 ± 21 ng per 105 viable cells per 72 h, while transfecting cells with plasmid pEGFP/E2 was ~15 ± 3 ng per 105 viable cells per 72 h. It should be noted that the observed difference in the expression levels of the protein was not due to the decrease in metabolic activity of cells or more significant cytotoxicity of the pEGFP/E2 and polyethyleneimine complexes. We demonstrated that the introduction of ITR AAV-2 into the plasmid vector did not significantly affect the duration of expression and persistence of the transgene in HEK293 cells in the absence of selective pressure. It was found that the recombinant plasmid constructs pTR-BKneo- and pBS-BK can induce the production of antibodies specific to the E2 fragment CSFV in mice. For the first time, it has been demonstrated that the introduction of ITR AAV-2 sequences into the vector construct of a model marker DNA vaccine against CSF leads to an increase in both the intensity and duration of the humoral immune response to immunization. The use of heterologous booster vaccination could significantly increase the immunogenicity of candidate vaccines, reduce their reactogenicity, and the likelihood of the development of an immune response to the vector. Our data indicate that booster immunization with a recombinant fragment of the E2 protein of CSFV performed after double immunizations with the plasmid vector pTR-BKneo- leads to a significant increase in the synthesis of antibodies specific to the target antigen, compared with three injections of pTR-BKneo-.One of the promising strategies to enhance the immune response to DNA vaccination, which has been considered recently, is the introduction of so-called "gene adjuvants" - recombinant vectors that carry genes encoding cytokines, chemokines, or co-stimulatory molecules. In this work, we created recombinant constructs pmIL12-TR and pmIL2-TR, which contain mouse genes interleukin-12 and interleukin-2, respectively, under the transcriptional control of the promoter/enhancer of early/immediate human cytomegalovirus genes in the expression cassette located between ITR AAV-2. We also created their derivatives pTR-mIL2 / EGFP and pTR-mIL2 / EGFP, which contain the chimeric genes of IL2 / EGFP and IL12 / EGFP proteins. In vitro study of the functional activity of the generated vectors showed that chimeric proteins are expressed from the generated recombinant constructs in HEK293 cells and are partially secreted from the cells into the conditioned medium. The combined administration of pTR-BKneo- and genes of murine interleukin-2 and chimeric interleukin-12 in the created recombinant constructs enhances the humoral immune response to E2 CSFV. Moreover, the enhancement effect is the most pronounced in the group of animals that received 10 μg of pmIL12-TR and pmIL2-TR in combination with pTR-BKneo-.

Дисертаційне дослідження присвячене вивченню терапевтичного ефекту МСК при терапії синдрому поліорганної дисфункції та з'ясуванню можливих молекулярних механізмів такої дії. Дослідження проводились із застосуванням лабораторних мишей лінії ICR та відтвореної моделі системного ураження організму з синдромом поліорганної дисфункції.Для дослідження терапевтичної дії мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) було відтворено та охарактеризовано тваринну модель, яка відповідає важкому стану поліорганної патології при якому дисфункція одного органу зумовлює розвиток вторинної дисфункції інших, що в свою чергу підсилює порушення в першому. Принциповою особливістю розробленої моделі є генетично-обумовлена схильність піддослідних тварин до пухлиноутворення, що відтворює зростаючу схильність до канцерогенезу людини, а на моделі забезпечує прояв можливих канцерогенних властивостей досліджуваних МСК. Показано, що в умовах активації канцерогенезу трансплантовані МСК додатково не прискорюють процеси пухлиноутворення, а в деяких випадках можуть їх і гальмувати. На підставі отриманих даних було сформульовано гіпотезу, що пояснює явище Пускового ефекту, який призводить до активації резидентних МСК і прогеніторів.Показано, що трансплантовані МСК за умов важкого системного ураження організму не втрачають свої відновлювальні регуляторні властивості, активують процеси відновлення органів і можуть бути запропоновані для детальної розробки протоколів терапевтичного застосування при зазначених станах.^UPresent Ph.D. thesis is devoted to the study of MSCs therapeutic effect in the treatment of multiorgan dysfunction syndrome and to the elucidation of possible molecular mechanisms of such action. The studies were performed on laboratory ICR mice and a reproduced model of systemic organism lesions with multiorgan dysfunction syndrome.To study the therapeutic effect of mesenchymal stem cells (MSCs), an animal model was developed and characterized, which corresponds to the severe condition of multiorgan pathology. The important feature of the created model is the genetically determined predisposition of experimental animals to tumor formation, which reproduces the growing predisposition to human carcinogenesis. So, such model provides a manifestation of possible carcinogenic properties of the studied MSCs.Tetrachloromethane (CCl4), whose metabolism in the cell causes the appearance of great number of reactive molecules and affects the permeability of membranes, was chosen as the factor that triggers the chain of destructive reactions in the created experimental animal model. With prolonged loading, the existing mechanisms of cell detoxification are depleted, which consistently leads to their death, the development of chronic inflammatory reactions and organ dysfunction. The severity of the model is confirmed by pathomorphological changes in vital organs and the mortality index at the stage of formation of the required level of pathology, which was 18-22% of the total amount of experimental animals.Therapeutic effects of allogeneic and xenogeneic MSCs in different concentrations, schemes of introduction and terms of therapeutic effect development are studied. This was performed against the background of the developed model by means of pathomorphological analysis and analysis of blood parameters.The study involved mouse embryonic fibroblast-like cells of mice ICR, BALB, FVB-Cg-Tg (GFPU) 5Nagy / J lines (FM), and mesenchymal stem cells from human Wharton jelly, which were positive for markers CD73, CD90, CD105.It has been shown that in general the therapeutic effects of allogeneic MSCs derived from different lines of mice are similar in many aspects. Differences in therapeutic effects related to the degree of induced proliferative activation in the regenerating organs. Thus, 3 weeks after MSCs transplantation from FVB mice, the proliferative activity of the liver cells of the recipient mouse was lower compared to the use of MSCs of BALB mice. Xenogeneic MSCs caused more pronounced inflammatory response than allogeneic, although the positive physiological effects and survival index were at the level of allogeneic MSCs of higher concentration use. That is, a single transplant of xenogeneic MSCs caused the same level of response as a triple transplant of allogeneic MSCs.The dependence of therapeutic effects on the concentrations of transplanted MSCs was established. Following doses and amount of exogenous cell transplants were studied: 1x10^4, 1x10^5 and 3x10^5 cells per mouse. Moreover, the "dose" 3x10^5 was divided into 3 transplants with 7-days break between them. The dose of 1x10^5 was calculated based on therapeutic doses of MSCs long-lasting clinical trials of MSCs in humans at that time. For this dose, partial restoration of pulmonary histoarchitectonics, partial restoration of white and red spleen pulp with signs of immune response activation, and regeneration of hepatocytes near vessels in the liver were shown. A lower dose of MSC - 1x10^4 cells per mouse also led to compensatory-adaptive responses and to the absence of alternative-necrotic changes, but the number of regenerating hepatocytes in the liver was smaller. In the more severe initial state, it was low to increase the survival index of experimental animals.It is shown that transplanted MSCs, in the conditions of systemic lesion of the organism, under the terms of exhausted detoxification mechanisms do not additionally activate and accelerate the development of tumors in animals with a hereditary predisposition to carcinogenesis. Systemic lesions realize a genetic predisposition to carcinogenesis, but even under these conditions, MSC transplantation did not lead to an intensification of this process.Based on the results of the analysis of the results obtained, a hypothesis of the possible mechanism of action of therapeutic MSCs was formulated. According to the hypothesis, resident ("watchdog") mesenchymal cells in chronic lesions / inflammation are in a depressed state, due to the cellular analogue of the protective physiological response – a decrease in excitability with prolonged exposure to stimuli. Thus, it is shown that transplanted MSCs under conditions of severe systemic damage of the body do not lose their restorative regulatory properties and can be proposed for detailed development of protocols for therapeutic use in these conditions.