На правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2019. Дисертаційна робота присвячена ідентифікації нових молекулярних компонентів механізмів глюкозної катаболітної регуляції та селективної пексофагії на моделі метилотрофних дріжджів. Встановлено, що сигналізування глюкози у механізмі транскрипційної індукції у H. polymоrpha опосередковується нетранспортуючим сенсором Hxs1, а механізм катаболітної репресії залежить від ефективності транспорту глюкози та потенційого трансцептора Gcr1. Аналоги транскрипційних факторів головного шляху репресії у S. сerevisiae, Mig1, Mig2 та Tup1, не є компонентами механізму глюкозної репресії у H. pоlymorpha, але є необхідними для фізіологічної регуляції типу пексофагії. Розроблено ефективний метод клонування ATG генів пексофагії. Встановлено, що функція продукту гену ATG26 –ергостеролглюкозилтрансферази, є селективно необхідною для пексофагії, але не загальної автофагії, і є консервативною у метилотрофів. Також показано, що продукт гену ATG28 є одним із спец ифічних компонентів автофагійного апарату, відповідальних за селективне розпізнавання пероксисом. Новий білок пероксисомних мембран, Pex36, є необхідним для процесів як біогенезу, так і деградації пероксисом у P. pastoris та H. polymorpha. Також встановлено консервативну роль компонента вакуолярного сортингу білків Vps15 у автофагійних процесах. Розроблена нова платформа для мультикопійної інтеграції векторів у геном H. роlуmorpha на основі маркерів селекції ADE1 та FLD1. Базуючись на мутантних штамах з пошкодженою глюкозною репресією, були сконструйовані ефективні продуценти ряду білків медичного та біотехнологічного значення.^UThe main topic of this dissertation work concerns elucidating molecular components involved in regulation of peroxisome biogenesis and autophagic degradation, signaling mechanisms that maintain their homeostasis, sensing of hexose compounds and related catabolite regulation. Yeasts are convenient eukaryotic models for such cell biology research. It is of a significant fundamental and practical interest as some aspects of the obtained knowledge can be translated to human health and various biotechnological processes. 43 Methylotrophic yeasts have a number of advantages for studies on catabolite regulation. Like most other so-called "non-conventional yeasts", they are obligatory aerobes whose signaling mechanisms are not adapted to fermentative growth. Synthesis of peroxisomal and cytosolic enzymes of methanol utilization as well as peroxisome prollifgeration are induced by methanol but is strictly repressed by sugars and ethanol, - effector molecules that rely on distinct catabolic pathways. Catabolite inactivation of peroxisomal enzymes by glucose or ethanol involves degradation of organelles in vacuoles via pexophagy. Signaling and structural mechanisms providing selectivity for autophagy, pexophagy in particular, still remaine not fully elucidated. We demonstrated that glucose signaling in the mechanism of transcriptional induction of glucose transporters in H. polymropha is mediated by a non-transporting sensor Hxs1 (Hexose sensor), whereas the signaling for transcriptional repression in H. pylymorpha is rather "non-conventional" and depends on glucose transport and on the unique to this species protein Gcr1 (Glucose catabolite repression), - a potential transceptor (transporting receptor), which also possesses a regulatory function in the absence of glucose. It has also been established that putative homologs of transcriptional factors of the main repression pathway in S. cerevisiae: Mig1, Mig2 and Tup1, are not the essential components of glucose repression mechanism in H. pоlymorpha. It was also observed that Gcr1 and Hxs1 do not directly participate in the signaling for pexophagy. However, the MIG1, MIG2 and TUP1 gene products are necessary for the physiological regulation of the autophagy type in response to exogenous stimuli. Based on the H. polymorpha mutants with aberrant glucose regulation and developed new approaches for multicopy vector integration, producers of a number of recombinant proteins of medical and biotechnological significance have been constructed. The proposed modified expression platform relies only on sugar substartes for regulation of recombinant protein production. Another goal was to identify new genetic elements controlling pexophagy, paying main atention on those not involved in general autophagy. A collection of P. pastoris pexophagy-deficient mutants has been isolated and a positive selection method for the cloning of the affected genes by functional complemetation elaborated. By functional analysis of mutants in several newly identified pexophagy genes in P. pastoris and H. polymorpha it has been established that function of the product of the ATG26 gene – ergosterolglucosyl transferase, is selectively required only for pexophagy, but not for the general autophagy, and is conserved in these two methylotrophs. It was also found that the product of the P. pastoris ATG28 gene is one of the components of the autophagic apparatus responsible for selective recognition of peroxisomes. A novel peroxisome membrane protein Pex36 has been identified as necessary for both peroxisome biogenesis and degradation in P. pastoris and H. polymorpha. Our data highlight the importance of comparative studies on signaling mechanisms in different yeast species from the point of view of both, fundamental science and biotechnological applications.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. – ДЗ «Дніпропетровська медична академія Міністерства охорони здоров'я України», 2021.Встановлено, що при внутрішньовенному введенні інфузійного розчину НАЕS-LX-5 % впродовж перших 7 діб після термічної травми шкіри в усі терміни спостереження у дослідних тварин дистрофічні та некробіотичні процеси в епідермісі та дермі були менш виражені, ніж у тварин з контрольної групи порівняння, що отримувала 0,9 % розчин NaCl. Позитивна динаміка морфологічних змін структурних компонентів шкіри, зменшення проявів альтерації, неоангіогенез, активна крайова проліферація епідермоцитів при застосуванні коригуючого чинника, пов'язані з властивістю НАЕS-LX-5 % утримувати плазму крові в судинах, що значно зменшує набряки, а також ендотелій-протекторною дією даного препарату.На ультраструктурному рівні дослідження встановлено, що позитивний ефект застосування коригуючого чинника більш виразний через 7 та 14 діб експерименту. Субмікроскопічний стан шкіри в пізні терміни після опіку (через 21 та 30 діб досліду) при застосуванні розчину HAES-LX-5 % свідчить про значну нормалізацію її структурних компонентів.^UWithin the framework of scientific cooperation between National Pirogov Memorial Medical University and SI "Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine" (Lviv) the effect of 0.9 % NaCl solution (control drug) and HAES-LX-5 % infusion solution at a dose of 10 ml/kg into the inferior vena cava for 7 days on the skin structure of intact rats, as well as on early (1, 3 and 7 days) and late (14, 21 and 30 days) periods after burn damage of the skin of the II-III degree with an area of 21-23 % of the body surface was investigated.Mature male rats, whose average weight was 160-180 g, were divided into 5 groups: group I – animals that underwent only femoral vein catheterization (intact rats, n=9); group II – catheterized animals without burns, with intravenous infusion of 0.9 % NaCl solution (n=54); group III – catheterized animals without burns, with intravenous infusion of HAES-LX-5 % (n=54); group IV – catheterized animals after skin burns, with intravenous infusion of 0.9 % NaCl solution (control) (n=54); group V – catheterized animals after skin burns, with intravenous infusion of HAES-LX-5 % (study drug) (n=54). All manipulations on rats were carried out according to the recommendations of the European Commission for biomedical research in the use of animals and the recommendations of the State Pharmacological Center of the Ministry of Health of Ukraine and the "Rules of preclinical safety assessment of pharmacological agents (GLP)" and rules of humane treatment of experimental animals (approved by the Bioethics Committee of National Pirogov Memorial Medical University).Histological examination of the skin of male rats, which during the first 7 days was administered 0.9 % NaCl solution or the drug HAES-LX-5 % found that in all periods of observation microscopic organization of skin components in both early and late stages of the study when entering these infusion solutions are similar to those in intact rats.At the ultrastructural level of study of rat skin components with the introduction of 0.9 % NaCl solution or HAES-LX-5 %, these solutions during all observation periods also do not change the submicroscopic organization of the epidermis, intercellular substance, cells and blood capillaries of the fibrous connective tissue of the papillary and papillary tissue.It was found that at the light-level of the study in the early stages of the experiment (1, 3 and 7 days) after thermal injury under conditions of 0.9 % NaCl solution compensatory-adaptive changes in the structural components of the skin are combined with signs of destructive disorders. In the epidermis of the affected area of skin there is the destruction of epithelial cells (all its layers). Vascular disorders in the dermis are combined with changes in fibroblasts, homogenization and edema of the components of the intercellular substance.In the late stages of the experiment (after 14, 21 and 30 days) there is a deepening of destructive changes in the structural components of the skin in the affected area. This process becomes irreversible. As a result, the formation of granulations and their maturation are slow. Marginal epithelialization of the wound with the formation of a full, differentiated into layers of regenerate is also slowed down. After 30 days of the experiment under the conditions of application of 0.9 % NaCl solution in the healing area there are no formed papillae of the dermis and skin appendages.At the ultrastructural level of the study of the skin of male rats after thermal trauma under the conditions of previous application of the first 7 days of 0.9 % NaCl solution it was found that in the early stages of the experiment – stages of shock and early toxemia (1, 3 and 7 days) compensatory-adaptive changes combined with signs of destructive disorders. In the epitheliocytes of the epidermis of the affected area of skin there is the destruction of the nuclei and cytoplasm. Vascular disorders in the dermis are combined with changes in fibroblasts, the intercellular substance of fibrous connective tissue.In the late stages of the experiment – the stages of late toxemia and septicotoxemia (14, 21 and 30 days) there is a further development and deepening of destructive-dystrophic changes of all ultrastructural components of the affected skin, which often become irreversible. The processes of granulation tissue formation, its transformation into connective tissue, as well as marginal epithelialization are slow.