Создана технологическая схема получения препарата "Тромбин" из фракции II + III плазмы крови по Кону, которая включает предварительное фракционирование, осаждение протромбинового комплекса, активацию, сольвент-детергентную обработку и аффинную хроматографию на кремнеземном сорбенте. В результате получен высокоактивный (удельная активность в элюате около 2 000 од. NIH/мг белка) с высоким уровнем антивирусной безопасности препарат, пригодный для диагностических или лечебных целей.

Узагальнено сучасні світові тенденції у сфері вірусної безпеки у процесі виготовлення препаратів плазми крові. Описано застосування запобіжних та елімінаційних заходів. Наведено основні методи вірусної інактивації, що застосовуються у технологіях фракціонування плазми крові.

Синтезовано сорбенти на підставі макропористих кремнеземних носіїв та лігандів - активних барвників тріазинової групи, придатні для виділення протеїназ трипсинового типу з плазми крові. Синтезовано сорбенти на основі макропористих кремнеземів, які містять в якості лігандів активні тріазинові барвники. Вивчено фізико-хімічні властивості одержаних сорбентів, які свідчать про їх високу стабільність, легкість регенерації, стійкість до дії мікроорганізмів, хімічних речовин та стерилізації. Досліджено сорбційно-десорбційні властивості синтезованих сорбентів щодо протромбіну, тромбіну, альбуміну, факторів згортання крові VIII та IX, які продемонстрували їх придатність для виділення та очищення цих білків. Синтезовані сорбенти відрізняються за специфічністю сорбції різноманітних білків. Ця специфічність зумовлена присутністю різноманітних за властивостями замісників у барвників-лігандів і здійснюється, очевидно, за змішаним типом за участі каталітичного активного центру ферменту та центрів зв'язування субстратів (інгібіторів), гідрофобної та іонної взаємодії. З використанням біоспецифічної хроматографії на синтезованих кремнеземних сорбентах створені технологічні схеми виділення та очищення досліджуваних білків з утильних фракцій переробки донорської плазми крові.

Розглянуто основні теоретичні та практичні підходи щодо відбору та використання детергентів та органічних розчинників для видалення вірусів з ліпідною оболонкою за умов одержання фармацевтичних та ветеринарних препаратів, їх переваги та недоліки. Наведено приклади застосування хімічних агентів для ефективної інактивації вірусів гепатитів В та С, а також імунодефіциту людини. Охарактеризовано методи відділення інактивуючих речовин від білкових препаратів. Описано сольвент-детергентний метод вірусної інактивації. Продемонстровано, що метод хроматографії з використанням макропористих кремнеземних сорбентів дозволяє з високою ефективністю та продуктивністю одержувати білкові препарати з плазми крові без присутності в них Тритону Х-100 та три(n-бутил)фосфату - потенційних токсичних агентів.

З метою корекції дефіциту фактора або для запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією А проводять замісну терапію, яка полягає у введенні плазмових або рекомбінантних препаратів фактора VIII. Для лікування гемофілії в Україні використовують низку препаратів фактора, як плазмового так і рекомбінантного походження. Залежно від ступеня очищення, відрізняють плазмові препарати проміжного ступеня очищення, одержані за допомогою традиційних методів осадження/адсорбції, та високоочищені препарати, виділені за допомогою методів іонообмінної або афінної хроматографії. З кінця 1980-х років у клінічній практиці почали використовувати рекомбінантні препарати фактора. Вони одержані за допомогою методів генної інженерії з лінії клітин яєчника китайського хом'яка або нирки новонародженого хом'яка. Рекомбінантні фактори поділяють на покоління залежно від вмісту домішкового білка людини чи тварини в кінцевому продукті. Проведено аналіз основних плазмових і рекомбінантних препаратів фактора VIII, зареєстрованих в Україні. Описано їх основні властивості, способи одержання та методи вірусної інактивації. Узагальнено переваги та недоліки плазмових і рекомбінантних препаратів фактора згортання крові.

Синтезовано сорбенти на основі використання макропористих кремнеземних матриць та активних тріазинових барвників як лігандів. Вивчено їх основні фізико-хімічні властивості. На прикладі модельної взаємодії барвників з тромбіном та альбуміном відібрано кращі сорбенти, які можуть бути придатні для виділення та очищення серинових протеїназ трипсинового типу з плазми крові. Вищою специфічністю до тромбіну серед досліджуваних барвників володіють Активний яскраво-голубий КХ, Procion blue НВ та Procion Gelb M-4R.

Технологічні процеси хроматографічного очищення широко використовуються в останні роки для фракціонування плазми крові. Впровадження іонообмінної, афінної та гель-проникної хроматографії сприяли виникненню нового покоління високоочищених та вірус-безпечних терапевтичних препаратів плазми, зокрема факторів зсідання крові. Мета дослідження - дослідити можливість використання методу хроматографічного очищення фактора VIII на кремнеземних сорбентах з тріазиновими барвниками в якості лігандів. Наведено результати досліджень очищення фактора VIII зсідання крові, яке є комбінацією попереднього фракціонування свіжозамороженої плазми з наступним етапом методу афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах. Охарактеризовано основні переваги і недоліки використання тріазинових барвників в ролі афінних лігандів. Запропонований метод охоплює попереднє осадження білків плазми цитратом барію, адсорбцію на гідроксиді алюмінію, відділення осаджених білків центрифугуванням і використання методу негативної афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах: діасорб-активний яскраво-голубий К, діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ, діасорб-Procion Blue HB, діасорб-Procion Gelb MXR. Продемонстровано, що поєднання попереднього фракціонування плазми крові з методом негативної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах із синтетичними барвниками як лігандів надає змогу досягти високого ступеня очищення фактора VIII (приблизно в 100 разів). Наприклад, використання сорбенту діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ збільшує питому активність фактора VIII з 0,017 +- 0,004 МО/мг до 1,940 +- 0,023 МО/мг білка. Наведена технологія може бути застосована одночасно з іншими видами хроматографії у схемі препаративного одержання фактора VIII зсідання крові.

Проблема переробки плазми донорської крові з метою створення ефективних лікарських препаратів є актуальною. На сьогоднішній день створено велику кількість методів фракціонування плазми крові, виділення і очищення її компонентів, зокрема, факторів зсідання крові та фібринолізу. Особливо привабливими з точки зору ефективності є методи біоспецифічної хроматографії. Хроматографічне очищення фактора VIII вважається одним із технологічно найважчих процесів через потенційний ризик його активації та нестабільність за наявності протеаз плазми крові. Для одержання очищених препаратів фактора VIII широко використовують аніонообмінну, гель-проникну й афінну хроматографії. Cинтетичні тріазинові барвники мають низку переваг як ліганди, досліджено можливість використання барвник-лігандної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних носіях для виділення й очищення фактора VIII зсідання крові. Описано сорбцію цього фактора з різними хроматографічними сорбентами та запропоновано спосіб його очищення із кріопреципітату за допомогою методу зв'язування нецільових білків на діасорб амінопропіловому з іммобілізованими тріазиновими барвниками. У результаті проведеної роботи було відібрано групу сорбентів, яка найкраще надається для процесу очищення фактора VIII зсідання крові: діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ, діасорб-procion gelb M4R, діасорб-procion blue HB, діасорб-procion blue MXR та діасорб-активний яскраво-голубий К. Очищення фактора VIII відбувалося завдяки явищу негативної афінної хроматографії. Питома активність цього фактора зростала приблизно на порядок.

Фактор VII використовують у разі кровотеч і операцій у хворих на гемофілію A або B з інгібіторами до факторів VIII або IX, а також для лікування хворих із вродженим чи набутим його дефіцитом. За походженням розрізняють плазмові та рекомбінантні препарати фактора. Для виділення й очищення препарату використовують класичні (переосадження неорганічними солями, моно- та поліспиртами, іонообмінну і гель-проникну хроматографію) та сучасні хроматографічні методи (біоспецифічну, імуноафінну хроматографію). Показано, що низка синтезованих авторами афінних сорбентів на основі кремнеземних макропористих матриць і тріазинових барвників-лігандів ефективно та зворотно зв'язує фактор VII. За допомогою вдало підібраних умов елюції вдалося одержати високоочищений препарат цього білка. Одержаний препарат фактора FVII за чистотою і специфічною активністю аналогічний до комерційних препаратів різних виробників. Технологія виділення фактора включає також стадії антивірусної обробки за допомогою сольвент-детергентного та тіоціанатного методів.

Індекс рубрикатора НБУВ: Р411.023.6-52 + Е70*732.22

Рубрики:

Гемофілія

Біологія людини

Шифр НБУВ: Ж28852/б. Пошук видання у каталогах НБУВ 

Зроблено огляд наукових публікацій, присвячених дослідженню будови, функції та біологічної ролі фактора VIII. Фактор VIII зсідання крові людини (антигемофільний фактор A) є ключовим компонентом системи гемостазу. Роль фактора VIII полягає у підвищенні каталітичної ефективності фактора IXa у процесі активації фактора X. Ген фактора локалізований на довгому плечі X-хромосоми розміром 186 тис пар нуклеотидів, що складається з 26 екзонів, розділених 25 інтронами. Фактор VIII є глікопротеїном з 2332 амінокислотних залишків і має доменну структуру конформації: A1-A2-B-A3-C1-C2. У результаті посттрансляційної модифікації (furin протеази) та під дією протеолітичних ферментів плазми крові цей білок розщеплюється на два ланцюги: важкий 200 кДа (A1-A2-B) і легкий 80 кДа (A3-C1-С2). У плазмі крові людини фактор VIII представлений кількома формами з молекулярними масами 170 - 280 кДа та наявний у концентрації 0,1 - 0,2 мкг/мл. Практично весь фактор у кров'яному руслі є в комплексі з фактором фон Віллебранда, який стабілізує його у кровотоці та є ключовим регулятором активності, оскільки, з одного боку, сприяє його активації тромбіном, а з іншого - запобігає розщепленню молекули фактора протеїназами. Дефіцит фактора VIII, кількісний або якісний, призводить до порушення системи зсідання крові та розвитку захворювання, відомого як гемофілія A, з частотою виникнення 1 на 5000 новонароджених. З метою корекції дефіциту фактора або запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією A проводять замісну терапію, яка полягає у введенні плазмових або рекомбінантних препаратів фактора VIII. Для лікування гемофілії A в Україні використовують зареєстровані препарати факторів зсідання крові як плазмового, так і рекомбінантного походження.