Гиппокальцин – нейронный Ca2+-сенсорный белок (NCS), который опосредуетвнутриклеточные сигнальные пути благодаря своей способности к Ca2+-зависимой 22транслокации из цитозоля на плазматическую мембрану. Несмотря на то, чтоподобная транслокация гиппокальцина и других NCS-белков достаточно хорошоизучена, никаких количественных оценок распределения гиппокальцина междуцитозолем и плазматической мембраной при базальном уровне внутриклеточнойконцентрации свободных ионов кальция ([Ca2+]i) получено не было. В этой работе мыпредложили простые и универсальные подходы для таких оценок. Мы показали, чтоуровень экспрессии экзогенного гиппокальцина (10 мкМ) в исследуемых нейронахгиппокампа по крайней мере втрое ниже по сравнению с концентрацией эндогенного.Таким образом, экзогенный белок можно использовать в качестве инструментавизуализации распределения, транслокации и взаимодействия гиппокальцина сбелками-мишенями без существенного влияния на эндогенную сигнализациюгиппокальцина. Используя метод восстановления флуоресценции послефотовыцветания (FRAP), мы показали, что коэффициент диффузии флуоресцентномеченого гиппокальцина в дендритах нейронов гиппокампа (~40 мкм/с) находится впределах диапазона значений, характерных для цитозольных белков, причемкоэффициент был примерно в 10 раз больше, чем для чисто мембранного белка. Обаэти результаты свидетельствуют о том, что гиппокальцин находится в основном вцитозоле дендритов нейронов гиппокампа. Прямое вычисление фракционногораспределения гиппокальцина на базальном уровне [Ca2+]i показали, что мембраннаяфракция гиппокальцина не превышает 8%. В целом, наши результаты говорят о том,что, будучи преимущественно цитозольным, гиппокальцин может умеренноактивировать свои мембранные белки-мишени даже в условиях покоя.^UHippocalcin (HPCA) is a neuronal calcium sensor (NCS) protein that providesintracellular signaling via its Ca2+-dependent translocation from the cytosol to the plasmamembrane. Although such translocation of HPCA and some NCS proteins is wellestablished, no quantitative estimates of HPCA distribution between the cytosol and plasmamembrane at a basal level of free intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) have beenobtained. Thus, it is still unknown whether HPCA regulates its plasma membrane targetsunder resting conditions. Moreover, exogenously expressed fluorescently-labeled proteins,widely used for biophysical studies, could probably shift endogenous proteins signaling.That's why the main issues in this study is the estimation of the expression level of the 23exogenous HPCA construct, compared to that of the corresponding endogenous one, andquantitative estimates of HPCA distribution between the cytosol and plasma membrane at abasal level [Ca2+]i. In this work, we propose a simple and universal approaches for suchestimations. The approach for measurement of expression level is based upon commonknowledge that the dye fluorescence is directly proportional to its quantum yield and thenumber of its molecules and that a coefficient of proportionality is determined by spectralproperties of the dye and optical equipment used to record fluorescent signals. If twofluorescent dyes are present in the same volume, then a ratio of their concentrations is equalto a ratio of their fluorescence multiplied by some dye- and equipment-dependentcoefficient. Thus, if the coefficient and concentration of one dye is known then theconcentration of another dye can be determined. Here we have demonstrated how tocalculate this coefficient (called a ratio factor) and how to use it for concentrationmeasurements of fluorescently tagged molecules. Using this approach, we estimated aconcentration of exogenously expressed HPCA, tagged by a fluorescent protein in adendritic tree of rat hippocampal neurons loaded via a patch pipette with Alexa Fluor dyeof known concentration. We have demonstrated that HPCA expression level (10 μM) in thehippocampal neurons under study is at least 3 times lower compared to the concentration ofendogenous one. Thus, the exogenous protein may be used as a tool to visualize HPCAdistribution, translocation and target interaction without substantial perturbation ofendogenous HPCA signaling. Next, we have evaluated HPCA spatial distribution in livingcells at a basal level of [Ca2+]i comparing this distribution with one of exogenouslyexpressed membrane protein, EYFP-Mem. Using fluorescence recovery afterphotobleaching, we showed that the diffusion coefficient of fluorescently tagged HPCA inthe dendrites of the hippocampal neurons (~40 μm2/s) is within a range of values typical forcytosolic proteins. The coefficient was about 10-fold higher than that for EYFP-Mem. Bothresults indicate that HPCA is mainly localized in the cytosol of the dendrites of hippocampalneurons. Subsequent direct calculations for HPCA fractions in the cytosol and plasmamembrane at a basal level of [Ca2+]i demonstrated that the plasma membrane fraction ofHPCA does not exceed 8%. Altogether, our results suggest that although being mainlycytosolic, HPCA may potentially signal to its plasma membrane targets under restingconditions. New approaches, used for obtaining such estimates, can be applied forquantitative evaluation expression level of NCS protein and its spatial distribution in livingcells under different experimental conditions and for development of precise biophysicalmodels of their signaling.