У препаратах мітохондрій, виділених з нирок і головного мозку бика, а також із печінки та мозку пацюка, виявлено активність тіамінтрифосфатази (ТТФ-ази). За умов заморожування - відтавання препаратів така активність визначається в розчині, що свідчить про розчинну природу ферменту. ТТФ-азна активність у цих розчинах та активність маркерних ферментів із мітохондрій за дії осмотичного шоку або зростаючих концентрацій тритону Х-100 свідчить про присутність ТТФ-ази в матриксі та в міжмембранному просторі мітохондрій. Величина молекулярної маси мітохондріального ферменту за допомогою методу гель-фільтрації відповідає масі специфічної цитозольної ТТФ-ази (3.6.1.28). Ферменти, однак, розрізняються за значенням <$E K sub м>: мітохондріальна ТТФ-аза виявляє вищу уявну спорідненість до відповідного субстрату. Одержані результати дозволяють дійти висновку про існування у клітинах ссавців множинних форм ТТФ-ази.

Із нирок бика виділено й очищено розчинну NTP-азу, яка відрізняється за низкою показників від відомих білків, які мають NTP-азну активність. Цей ензим виявляє максимальну активність за pH 7,5, що абсолютно залежить від наявності іонів двовалентних металів і за показниками гель-хроматографії його молекулярна маса складає 60 кДа. У досліджуваному діапазоні концентрацій (45 - 440 мкМ) субстрату інозин-5'-трифосфату активність NTP-ази підпорядковується кінетиці Міхаеліса - Ментен, а показник уявної Km для нього дорівнює 23,3 мкМ. Цей фермент має широку субстратну специфічність до каталізу гідролізу різних нуклеозид-5'-три- та дифосфатів.

Отмечено, что тиаминтрифосфат (ТТФ) присутствует в клетках различных типов - от бактерий до млекопитающих. У млекопитающих гидролиз ТТФ осуществляется специфичной растворимой ТТФ-азой, которая экспериментально не обнаружена у представителей других групп организмов. В базах данных NCBI и Ensembl найдена информация о полноразмерных и частичных аминокислотных последовательностях ТТФ-азы 38 видов млекопитающих. Скорость эволюционных замен аминокислот на сайт в год (<$E k sub roman aa>) в молекуле ТТФ-азы, рассчитанная исходя из имеющихся данных, равна <$E 1,41~cdot~10 sup -9>, что соответствует элементарному периоду эволюции примерно в 4,4 млн лет. Для разных участков полипептидной цепи этого энзима характерна различная скорость эволюции. Более вариабельны С-концевой фрагмент (<$E k sub roman aa~=~3,76~cdot~10 sup -9> рассчитана только для видов с длиной полипептида ТТФ-азы 230 ао и для слона) и центральная область (остатки 69-141; <$E k sub roman aa~=~1,95~cdot~10 sup -9>), тогда как <$E k sub roman aa> для N-концевой последовательности (остатки 1-68) составляет <$E 1,03~cdot~10 sup -9>, а для фрагмента 142-210 - <$E 0,81~cdot~10 sup -9>.

Из почек быка выделен каталитически активный фрагмент растворимой нуклеозидтрифосфатазы (NТРазы). Процесс очистки состоял из экстракции и 4 стадий колоночной хроматографии. Удельная активность NТРазы - 37,7 Е/мг протеина, степень очистки ~ 236 раз. Каталитический фрагмент NТРазы имеет pH-оптимум 7, проявляет абсолютную зависимость от катионов двухвалентных металлов и специфичность по отношению к ITP, GTP, UTP и ХТР; нуклеозиддифосфаты, АТP, CTP и ІМР не являются субстратами. Значения кажущихся Km для Мg - ITP, Mg - GTP и Mg - UTP-комплексов рассчитаны графическим методом в координатах Хейнса и соответственно равны 1,70, 0,93 и 0,48 мМ. По данным гель-фильтрации и электрофореза в ПААГ в присутствии DSNa каталитически активный фрагмент NTPазы состоит из двух одинаковых полипептидных цепей и имеет Мм 54,7 кДа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что растворимая NTPаза из почек быка состоит из каталитических и регуляторных структурных единиц.

Індекс рубрикатора НБУВ: Е60*725.111.431*04

Рубрики:

Загальна зоологія

Шифр НБУВ: Ж21341/а Пошук видання у каталогах НБУВ 
Повний текст  Наукова періодика України 

Отмечено, что у животных тиаминмонофосфат (TMP) является интермедиатом на пути деградации коэнзимной формы витамина B1 - тиаминдифосфата. В настоящее время энзимы, участвующие в метаболизме TMP в тканях животных, не идентифицированы. Цель работы - исследование гидролиза TMP в печени кур. В гомогенате печени обнаружены 2 энзима с активностью TMPазы - растворимый с pH-оптимумом в кислой среде (pH 6,0), и мембраносвязанный, активность которого максимальна при pH 9,0. Мембраносвязанная фосфатаза в присутствии 5 мМ Mg<^>2+ активировалась в 1,7 раза. Кажущаяся Km этого энзима для TMP, рассчитанная в координатах Хейнса, составляет 0,6 мМ. Левамизол ингибировал мембранную TMPазу по бесконкурентному типу с Ki = 53 мкМ. Активность растворимого энзима не зависит от ионов Mg<^>2+ и не ингибируется левамизолом, кажущаяся Km для TMP равна 0,7 мМ. По данным гель-фильтрации на колонке с тойоперлом HW-55 молекулярная масса растворимой TMPазы составляет 17,8 кДа, при этом пик активности TMPазы совпадает с пиками флавинмононуклеотид- и п-нитрофенилфосфатазной активности. Полученные результаты указывают на то, что TMP является физиологическим субстратом низкомолекулярной кислой фосфатазы, известной также как низкомолекулярная протеин-фосфотирозин-фосфатаза. Гидролиз TMP, наблюдаемый в гомогенате печени кур при щелочных pH, обусловлен действием щелочной фосфатазы.

Отмечено, что энзимы, участвующие в метаболизме тиаминтрифосфата (ТТФ) в тканях птиц, в настоящее время не охарактеризованы. Цель работы - исследование свойств ТТФ печени кур (Gallus gallus). Установлено, что зависимость скорости гидролиза ТТФ в гомогенате печени от рН описывается колоколообразной кривой с максимумом при рН 5,5 - 6,0. Катионы двухвалентных металлов (Mg²⁺, Ca²⁺) увеличивали активность ТТФ в 17 - 20 раз, в присутствии 5 мМ Mg²⁺ кажущаяся K_M энзима для ТТФ, рассчитанная методом нелинейной регрессии и в координатах Хейнса, составляет 1,7 - 2,2 мМ. Моновалентные анионы (I^-, SCN^-, NO₃^-, Br^-, Cl^-) в концентрации 150 мМ проявляли ингибирующее действие, снижая скорость ТТФазной реакции на 20 - 60 %. После центрифугирования гомогената печени более 85 % ТТФазной активности обнаруживалось в осадке, что свидетельствует о мембранной локализации энзима. Обработка осадка 1 %-ым дезоксихолатом натрия приводила к солюбилизации 53 % ТТФазной активности. При хроматографии на колонке с тойоперлом HW-55 ТТФаза элюировалась совместно с аденозин- и инозинтрифосфатазой в объеме, соответствующем протеинам с молекулярной массой ~ 700 кДа. Полученные данные свидетельствуют о том, что гидролиз ТТФ в печени кур осуществляется мембраноассоциированным протеиновым комплексом, обладающим широкой субстратной специфичностью.