Зроблено огляд сучасних експериментальних даних в галузі вивчення біосинтезу полікетидів - однієї з найбільших груп природних сполук, що проявлють широкий спектр цінних біологічних властивостей. Розуміння генетичних і біохімічних аспектів полікетидного синтезу дозволяє створити рекомбінантні штами мікроорганізмів, що продукують нові сполуки з передбачуваною структурою. Описано основні методи генетичного "дизайну" нових полікетидних сполук, наведено приклади геноінженерного конструювання продуцентів промислово важливих полікетидних антибіотиків.

Вивчено мінливість штаму Streptomyces sioyaensis Lv81 за рівнем синтезу тіопептидного антибіотика сіоміцину при вирощуванні на повноцінних живильних середовищах. Найвищу антибіотичну активність він має на соєвому середовищі. Досліджено вплив ультрафіолетового опромінення на виживання спор і антибіотичну активність штаму S. sioyaensis Lv81. Опромінення ультрафіолетом у дозі, що викликає падіння виживання спор до 0,2 %, ефективне для відбору мутантів з підвищеним синтезом сіоміцину. Для порівняльного аналізу рівня біосинтезу сіоміцину вихідним штамом та його мутантами, а також пошуку клонів з підвищеною продукцією цього антибіотика доцільно використовувати метод, що грунтується на стимулюванні сіоміцином росту на середовищі з канаміцином штаму Streptomyces lividans ТК24, який містить плазміду pMO16 з геном канаміцин- і неоміцин-стійкості neo під контролем tipA-промотора.

Исследовано влияние N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (НГ) и N-метил-N-нитрозометилмоченины (НММ) на жизнеспособность и антибиотическую активность продуцента сиомицина S. sioyaensis Lv81. Установлено, что оптимальными для получения клонов с повышенной антибиотической активностью являются дозы НГ и НММ, при которых выживает, соответственно, 20 - 30 % и около 0,2 % спор штамма. Для обнаружения клонов S. sioyaensis Lv81 с повышенным синтезом сиомицина можно использовать метод, основанный на стимулировании сиомицином роста на среде с канамицином штамма Streptomyces lividans ТК24, несущего плазмиду pMO16 с геном канамицин- и неомицин-устойчивости neo под контролем tipA-промотора.

Проведен биоинформатический анализ генома S. ghanaensis ATCC14672. В геноме S. ghanaensis обнаружены два гена, гомологичных гену dasR в S. coelicolor, продукт которого является членом семейства регуляторов GntR. DasR - плейотропный регулятор, который негативно регулирует биосинтез антибиотиков, метаболизм N-ацетилглюкозамина и спорообразование. В кластере генов биосинтеза моеномицина А идентифицированы вероятные последовательности dre, с которыми может связываться белок DasR. Получено нокаут гена dasR в штамме S. coelicolor М145. Для штамма дикого типа М145 характерно увеличение синтеза пигментированных антибиотиков актинородина и ундецилпродигиозина на минимальной среде с добавлением N-ацетилглюкозамина. Такого эффекта не наблюдалось в штамме с нокаутом гена dasR (S. coelicolor M145<$E DELTA> dasR). Осуществлена гетерологическая экспрессия кластера генов биосинтеза моеномицина А в штаммах S. coelicolor M145 <$E DELTA~dasR> и S. coelicolor M145. Анализ антибиотической активности этих штаммов показал, что ген dasR S. coelicolor M145 негативно регулирует экспрессию генов биосинтеза моеномицина А. Синтез моеномицинов в штамме с нарушенным геном dasR был вдвое выше, чем в штамме S. coelicolor, который содержит функциональный ген dasR.

Вивчено вплив різних факторів на біосинтез моеноміцинів штамом дикого типу S. ghanaensis ATCC14672 та гетерологічним господарем S. albus R1, що містить гени біосинтезу моеноміцинів на косміді moeno38-5+. Визначено оптимальні поживні середовища, що забезпечують найвищі титри продукції антибіотика штамом дикого типу та гетерологічним господарем. Підвищені концентрації глюкози спричиняють суттєве зниження рівня біосинтезу моеноміцинів. Негативний вплив на біосинтез антибіотика має і підвищений вміст неорганічного фосфату. Максимум накопичення антибіотика у міцелії припадав на п'яту добу вирощування у рідких середовищах. Для штаму S. ghanaensis оптимальною температурою для синтезу моеноміцинів є 37 <$E symbol Р>C, тоді як S. albus R1 moeno38-5+ утворює приблизно однакові кількості моеноміцинів як при 28, так і при 37 <$E symbol Р>C.

Зроблено огляд сучасних досягнень у галузi дослiдження сайт-специфiчних рекомбiназ (ССР) та їхнього практичного використання для манiпуляцiй геномами про- та еукарiотiв. Розглянуто принципи функцiонування ССР та основнi типи каталiзованих ними генетичних перебудов. Приклади, наведенi у цьому оглядi, демонструють потенцiал ССР для розв'язання широкого кола фундаментальних та практичних проблем, вирiшення яких iншими методами було б набагато складнiшим aбo й неможливим. Застосування ССР для ширшого кола бiологiчних систем, створення ССР, експресiя яких суворо контролюється у часi i просторi, та пошук рекомбiназ iз новою субстратною специфiчнiстю є основними напрямами подальшого розвитку технологiї сайт-специфiчної рекомбiнацiї.

Досліджено ознаки стійкості продуцента тіопептидного антибіотика сіоміцину S. sioyaensis Lv81 до антибіотиків із різним механізмом дії. Штамові дикого типу S. sioyaensis Lv81 властива природна стійкість до <$E beta>-лактамних антибіотиків і поліміксину. Цей штам має високий рівень стійкості до тіостептону - найближчого за структурую до сіоміцину тіопептидного антибіотика. Однак він виявляє чутливість до низьких концентрацій рифампіцину та стрептоміцину, а також більш чутливий до макролідних антибіотиків - олеандоміцину й еритроміцину, ніж більшість досліджених стрептоміцетів. Вивчено вплив різних концентрацій стрептоміцину, рифампіцину й еритроміцину на виживання спор S. sioyaensis Lv81.

Досліджено ріст низки актиноміцетів на відвальних породах вугільного виробництва за умов прямої інокуляції у породу відвалу (in vivo) та глибинного культивування в середовищах, що містять породу (in vitro). Виявлено, що популяція Streptomyces sioyaensis практично зберігає свою чисельність після 22 місяців існування (з кінця червня 2009 по травень 2011 року) у породі відвалу в межах кореневої системи берези. Водночас титр Streptomyces sioyaensis знижувався на 3 - 4 порядки у породах без рослинного покриву. В експериментах in vitro S. sioyaensis та 4 актиноміцетних ізоляти з ризосфери берези Betula pendula продемонстрували різну ефективність росту, яка підвищувалася за умов сумісного культивування штамів.

Вивчено гени продукції ангуциклічних, пептидил-нуклеозидних і фосфогліколіпідних антибіотиків у контексті технології комбінаторного біосинтезу нових антибіотиків у актиноміцетів. Опрацьовано метод геномного сканування для швидкого виявлення нових кластерів генів біосинтезу антибіотиків. Виявлено значну взаємодію між структурними генами біосинтезу, генами регуляції й експортування антибіотика, що впливає на рівень продукції чи спектр синтезованих сполук. З'ясовано, що ця взаємодія має вирішальне значення для високого рівня продукції нових антибіотиків за умов гетерологічної коекспресії генів, що походять з різних біосинтетичних шляхів. Кодон-залежна пост-транскрипційна регуляція синтезу антибіотиків, координація експорту та синтезу антибіотиків, модульність біосинтезу - універсальні механізми, що оперують у всіх досліджених біосинтетичних стратегіях. На їх основі простежено унікальні регуляторні та біосинтетичні механізми, що зумовлюють структурну та біологічну різноманітність продуктів вторинного метаболізму.

Продуцентом глікопептидного антибіотика тейкопланіну, який використовують як "останню лінію оборони" проти мультирезистентних коків, є бактерія Actinoplanes teichomyceticus. Кластер генів біосинтезу цього антибіотика (tcp) клоновано 8 років тому. Тим не менше, на даний момент немає даних про регуляцію біосинтезу цієї сполуки і загалом про геномну організацію, оскільки до недавнього часу не проводилися генетичні маніпуляції зі штамами A. teichomyceticus. У актиноміцетів глобальні регуляторні bld-гени координують як морфогенез, так і синтез антибіотиків. У Streptomyces coelicolor ідентифіковано більше 10 bld-локусів, і вони формують так званий каскад bld-генів, який надає змогу стрептоміцетам адаптуватися до мінливих умов середовища. Ген bldD кодує білок, розміщений у кінці сигнального каскаду. Його продукт - ключовий репресор генів морфологічної диференціації та антибіотикоутворення протягом вегетативного розвитку. Описано аналіз геному A. teichomyceticus на присутність компонентів bld-каскаду та детальніший аналіз причетності BldD до регуляції біосинтезу тейкопланіну. Використано раніше описані в геномах стрептоміцетів консенсусні послідовності операторів, з якими взаємодіє білок BldD. Декілька ймовірних операторів BldD знайдено у межах tcp-кластера, що свідчить про його регуляцію за допомогою BldD. Використовуючи підходи порівняльної геноміки, виявлено усі гени BldD-каскаду в частково секвенованому геномі A. teichomyceticus. Загалом, дані вказують на те, що BldD-залежна регуляція присутня не лише у видах роду Streptomyces, але й у представників роду Actinoplanes.

Ділянка кластера генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластера) S. globisporus 1912, що фланкує структурні гени lndZ4-Z6, містить чотири відкриті рамки зчитування - lndW, lndW2, lndYR і lndY. Ген lndY кодує імовірну Ser/Thr протеїнкіназу, котра, як передбачалося, разом з репресором LndYR може контролювати продукцію ландоміцинів і морфогенез у S. globisporus 1912. Однак результати виконаних експериментів свідчать, що за лабораторних умов ген lndY не задіяний у цих процесах. З використанням транскрипційного злиття промотора lndWp із репортерним геном катехолдиоксигенази хуlЕ вивчено характер взаємодії промотора lndWp з репресором LndYR у часі та опрацьовано систему скринінгу лігандів LndYR in vivo.

Зроблено огляд сучасних досягнень в дослідженні та практичному застосуванні плейотропних генів, які регулюють продукцію антибіотиків у актиноміцетів. Розглянуто основні регуляторні механізми за участі таких генів, що виявлені у цих бактерій. Наведені в огляді приклади демонструють, що маніпулювання регуляторними системами, які впливають на синтез антибіотиків, є важливим напрямком метаболічної інженерії актиноміцетів. Крім того, вивчення цих генів є підгрунтям для розробки генно-інженерних підходів до активації "мовчазної" частини вторинного метаболому актиноміцетів, потенціал якого щодо продукції біологічно активних сполук значно перевищує той, що вивчено за допомогою традиційного скринінгу мікроорганізмів. Крім суто практичних завдань, дослідження плейотропних регуляторних генів надасть змогу краще зрозуміти шляхи еволюції складних регуляторних систем, що координують експресію генних оперонів, кластерів і регулонів, задіяних у контролі вторинного метаболізму та морфогенезу актиноміцетів.

Мета роботи - дослідження протипухлинного потенціалу ангуциклінового антибіотика ландоміцину A (ЛА) щодо пухлинних клітин гострого промієлоцитарного лейкозу людини лінії HL-60 і її резистентних до ліків субліній HL-60/vinc, HL-60/adr, які характеризуються надекспресією АВС-транспортерів P-глікопротеїну (P-gp) та MRP1, відповідно. Показано, що досліджувана сполука мала виражену дозозалежну цитотоксичну активність щодо цих ліній клітин in vitro зі значенням LС50, що було співмірним або навіть нижчим, ніж для доксорубіцину (Дх) - "золотого стандарту" хіміотерапії. ЛА призводив до зупинки клітин лінії HL-60 у фазі G1 клітинного циклу з подальшою індукцією апоптозу. Встановлено, що ЛА не є субстратом для білків-транспортерів ліків, оскільки надекспресія цих білків мала незначний вплив на його антинеопластичну активність, на відміну від доксорубіцину, стійкість до якого зростала у 13 - 72 разу, залежно від сублінії клітин. У той же час застосування верапамілу (інгібітор P-gp, MRP-1) призводило до повного відновлення чутливості резистентних субліній HL-60/vinc і HL-60/adr до доксорубіцину, однак ніяк не впливало на протипухлинний потенціал ЛА. Одержані результати вказують на перспективність застосування ЛА в лікуванні пухлин, стійких до ліків.

Виділено чисту культуру пурпурових несіркових бактерій із води озера Яворівське (Львівська область, Україна), яке утворилося в результаті затоплення території сіркового кар'єру. Суспензія виділеного штаму Yа-2016 має рожево-червоне забарвлення. Вібріоїдні клітини є рухомими, грамнегативними, не утворюють спор. Розміри клітин <$E1,5~-~1,8~times~0,4~-~0,46> мкм. У клітинах бактерій виявлено внутрішні мембрани везикулярного типу. Ріст штаму пригнічується за внесення NaCl (1 г/л). Як субстрати для фототрофного росту бактерії використовують сульфід, тіосульфат і низку органічних сполук. Для росту потребують вітамін B12. Нуклеотидна послідовність консервативної ділянки гена 16S рРНК виявляє високу подібність (99 % ідентичних залишків у попарному вирівнюванні за допомогою методу BLASTN) до 16S рРНК бактерій роду Rhodopseudomonas. На основі дослідження морфофізіологічних характеристик і аналізу нуклеотидних послідовностей гена 16S рРНК пурпурові фотосинтезувальні несіркові бактерії штаму Yа-2016, виділені з води озера Яворівське, ідентифіковані як Rhodopseudomonas sp. Yа-2016.