Із використанням моноклональних антитіл показано, що BbetaN-регіон молекули фібрину desA (Bbeta1-53) містить сайт полімеризації, що включає пептидний зв'язок Bbeta14-15, який бере участь у другій стадії полімеризації фібрину - латеральній асоціації протофібрил. У фрагменті Bbeta15-53 також виявлено сайт, названий "C", який разом із сайтом "А" бере участь у першій стадії полімеризації - утворенні протофібрил. Створено модель первинної міжмолекулярної взаємодії фібрину. В N-кінцевій половині gamma-ланцюга D-регіону фібрину із застосуванням моноклональних антитіл II-4d виявлено сайт ("с"), який бере участь у побудові протофібрил і, за припущенням, є комплементарним сайту "C". Знайдено дві неоантигенні детермінанти, одна з яких експонується в суперспіральному фрагменті фібрину Bbeta126-135 в результаті відщеплення фібринопептидів А від фібриногену тромбіном. Зміна просторової структури молекули фібрину, що її виявлено в цьому сайті, є необхідною для здійснення подальшої латеральної асоціації протофібрил. Друга неоантигенна детермінанта формується у фрагменті Bbeta134-190 D-димеру, який утворюється під час розщеплення фібрину, стабілізованого FXIIIa, плазміном. Проти першої детермінанти одержано фібринспецифічне моноклональне антитіло FnI-, а проти другої - D-димер-специфічне III-3b. Одержано 3 моноклональних антитіла проти alphaС-регіону молекули фібрин(оген)у. За допомогою одного з них експериментально показано, що alphaС-домен з'єднаний з фібринопептидом B у фібриногені та у фібрині desA. Цей домен відходить від остова молекули після відщеплення фібринопептидів B тромбіном. Два інших моноклональних антитіла специфічно інгібують полімеризацію фібрину блокуванням двох невідомих сайтів полімеризації в alphaС-регіоні. На основі моноклональних антитіл FnI- і III-3b, використовуваних як "catch"-антитіла, і антитіл II-4d - як "tag"-антитіла розроблено тест-системи для кількісного визначення розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові людини. Ці тест-системи апробовано в клінічних випробуваннях в Україні. Показано, що для прогнозування післяопераційних тромботичних ускладнень, а також для контролю ефективності антитромботичної терапії є необхідним одночасне кількісне визначення розчинного фібрину та D-димеру до операції та в різні періоди після операції. Тільки в цьому разі можна одержати інформацію про стан балансу між системами зсідання крові та фібринолізу і визначити ступінь загрози тромбоутворення.

Зазначено, що дифтерія є висококонтагіозним і небезпечним для життя бактеріальним токсинопосередкованим захворюванням, яке спричинюється токсигенними штамами Corynebacterium diphtheria, трансформованими бактеріофагом, який несе ген токсину. Збудник дифтерії та його основний фактор вірулентності - дифтерійний токсин - досить добре вивчено, проте спалахи цього захворювання ще й досі виникають в усьому світі. На цей час бурхливий розвиток нових методів у галузі імунології та молекулярної біології сприяє вдосконаленню профілактики, діагностики та лікування дифтерії. В огляді висвітлено мікробіологічні, епідеміологічні, а також імунологічні аспекти дифтерійної інфекції, роль дифтерійного токсину та інших факторів вірулентності в патогенезі захворювання, роль гуморального антитоксичного імунітету в протидифтерійному захисті, а також перспективи розроблення нових діагностичних тестів, протидифтерійних вакцин, імунобіологічних препаратів та антидотів для боротьби з дифтерійною інфекцією.

Індекс рубрикатора НБУВ: Р514.23

Рубрики:

Дифтерія

Шифр НБУВ: Ж100178 Пошук видання у каталогах НБУВ 
Повний текст  Наукова періодика України 

Субодиниця B дифтерійного токсину (ДТ), яка складається із 2-х доменів, R - рецепторного та Т - трансмембранного, відіграє важливу роль у зв'язуванні токсину з рецептором на клітинах-мішенях та у транспортуванні каталітичної субодиниці A до цитозолю. Рекомбінантні аналоги субодиниці B є перспективними представниками унікального класу транспортувальних протеїнів, які здатні забезпечити доставку біологічно активних молекул до цитозолю клітин. Створення таких конструкцій вимагає з'ясування ролі кожного із фрагментів ДТ у транспортуванні комплексу рецептор - токсин. Досліджено роль T-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні рекомбінантних фрагментів ДТ. Для цього порівнено особливості внутрішньоіклітинного транспортування R-домену та субодиниці B, яка містить в собі як R-, так і Т-домен. Рекомбінантні фрагменти ДТ мітили флуоресцентними протеїнами, що надало змогу використовувати в дослідженні техніку колокалізації. За допомогою методу конфокальної мікроскопії встановлено відмінності у транспортуванні рекомбінантних похідних ДТ у клітинах лінії Vero. Показано, що R-домен швидше потрапляє до тубулярних компартментів клітини, ніж субодиниця B. Аналіз колокалізації R-домену та субодиниці B підтверджує майже лінійне її зростання за коефіцієнтом Пірсона (PCC) у разі збільшення часу інкубації. Проте відсоток субодиниці B, колокалізованої з R-доменом, визначений за коефіцієнтом Мандерса (M1), зростає нелінійно, що може свідчити про здатність субодиниці В потрапляти до певних компартментів клітини, недоступних для R-домену. Роль T-домену у внутрішньоклітинному транспортуванні та компартменталізації токсину, вірогідно, пов'язана з його здатністю до формування протонних каналів і взаємодії з комплексом протеїнів цитоплазми COPI.

З використанням метаболічного мічення <$E nothing sup 14 roman С>-ацетатом вивчено вплив підвищеного рівня глюкози на продукцію гіалуронової кислоти (ГК), гепаран сульфату (ГС), хондроїтин сульфату (ХС) і дерматан сульфату (ДС) культивованими ендотеліальними клітинами. Показано, що 48-годинна інкубація клітин у 30 мМ глюкозі спричинює зменшення накопичення ГС і збільшення - ХС та ДС у клітинному шарі, перицелюлярному матриксі та кондиційованому середовищі. Зміни загального метаболізму сульфатованих глікозаміногліканів контрастують з перерозподілом ГК між кондиційованим ендотеліальними клітинами середовищем і перицелюлярним матриксом. Преінкубація в умовах 30 мМ глюкози збільшує також прикріплення клітин, які було оброблено гіалуронідазою, до іммоболізованної ГК, але не впливає на прикріплення клітин до полі-D-лізину. Це свідчить про зміни у зв'язуванні ГК з її рецепторами (CD44). Оброблення ендотеліальних клітин р-нітрофеніл-<$E beta>-D-ксилопіранозидом, що інгібує з'єднання ХС з їх коровими білками, зменшує накопичення перицелюлярної ГК і прикріплення клітин до іммобілізованої ГК. Припущено, що ХС, які входять у склад CD44, залучені до накопичення перицелюлярної ГК ендотеліальними клітинами під впливом підвищеного рівня глюкози.

Запропоновано метод визначення афінності антитіл за допомогою ELISA, що грунтується на нових координатах. Запропонований підхід є надзвичайно простим і разом з тим він позбавлений деяких недоліків, властивих відомим раніше і широко використовуваним методaм B. Friguet et al. (1985). Наведено приклади застосування нового підходу для визначення афінності антитіл з використанням як теоретичних, так і експериментальних кривих зв'язування антитіл з іммобілізованим на імунологічних платах антигеном. Теоретичні та експериментальні криві зв'язування антитіл розглянуто за умови, що ці антитіла є частково заблоковані антигеном, який знаходиться в розчині разом з антитілами, причому концентрація вільних паратопів антитіл та концентрація комплексів антиген - антитіло є в стадії динамічної рівноваги.

Індекс рубрикатора НБУВ: Р645.021.19

Рубрики:

Інші наркоманії

Шифр НБУВ: Ж21341/а Пошук видання у каталогах НБУВ 

Вивчено експресію різних форм 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази (ФФКФБ) в злоякісних пухлинах легень людини. Виявлено посилену експресію ФФКФБ-1, -2, -3 та -4 мРНК в злоякісних пухлинах у порівнянні з нормальною тканиною легень, взятою від тих самих пацієнтів. Методом імуноблотінгу показано значне збільшення рівня ФФКФБ-4 і -3. Встановлено, що експресія ФФКФБ-2, -3 та -4 мРНК в А549-клітинах карциноми легень також збільшена у порівнянні з нормальною тканиною легень і різко посилюється за умов гіпоксії. Результати дослідження свідчать про посилену експресію ізоферментів ФФКФБ і можливу роль їх в ефекті Варбурга.

Вивчено експресію 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-3 (PFKFB-3) у різних органах мишей за гіпоксії in vivo. Виявлено суттєве посилення експресії мРНК PFKFB-3 у легенях, сім'яниках і головному мозку мишей за умов гіпоксії. Відкрито декілька нових альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-3, які різняться між собою довжиною та послідовністю амінокислот C-кінцевої регуляторної ділянки, але їх каталітичні домени для 6-фосфофрукто-2-кінази та фруктозо-2,6-бісфосфатази є ідентичними. Встановлено, що експресія різних альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-3 має органну специфічність і посилюється за умов гіпоксії по-різному. Результати дослідження вказують на можливу роль сплайс-ізоформ PFKFB-3 в адаптації клітин організму до гіпоксії.

Вивчено експресію 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 (PFKFB-4) в різних органах щурів. Виявлено декілька нових альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-4, які мають делеції або вставки різної довжини в фруктозо-2,6-бісфосфатазній частині молекули зі зміною довжини та рамки зчитування С-кінцевої ділянки, але каталітичні домени для 6-фосфофрукто-2-кінази в них є ідентичними. Встановлено, що експресія обох альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-4 має органну специфічність і суттєво змінюється під впливом метил-третбутилового ефіру, екологічно небезпечної сполуки. Результати дослідження вказують на можливу роль сплайс-ізоформ PFKFB-4 у тканиноспецифічній регуляції гліколізу та чутливості процесів регуляції альтернативного сплайсингу до дії токсичних хімічних сполук, зокрема метил-третбутилового ефіру.

The involvement of nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) <$E alpha 7> subtype in B lymphocyte activation has been investigated. B lymphocytes were magnetically separated from the spleens of C57Bl/6J mice. The purified lymphocytes were treated with fluorescently labeled IgM-, CD40- , CD16/32 or CD23-specific antibodies and unlabeled <$E alpha 7>-specific antibody and examined by flow cytometry. The <$E alpha 7>-specific antibody binding interfered with that of anti-CD40 but not of anti-IgM, anti-CD16/32 or anti-CD23 suggesting that <$E alpha 7> nAChRs are located close to CD40. В lymphocyte activation either in vitro with anti-CD40 or in vivo by immunization with cytochrome c resulted in increased <$E alpha 7> nAChR expression. Anti-CD40-induced B lymphocyte proliferation studied by <$E [ sup 3 roman H ]>thymidine incorporation was increased upon <$E alpha 7> nAChR inhibition with methyllicaconitine, choline or antibiotic gentamicin, as well as in the presence of the inhibitor of acetylcholine synthesis hemicholine-3. Mice injected with both cytochrome c and methyllicaconitine responded with IgM anti-cytochrome c antibodies faster than those injected with cytochrome с alone, while the secondary IgG responses were similar. It is concluded that <$E alpha 7> nAChRs negatively control CD40-mediated В lymphocyte proliferation but did not affect the IgM-IgG class switch or memory B cell activation. Endogenous acetylcholine may be regarded as an auto/paracrine regulator of B lymphocyte activation.

Дана робота - результат міждисциплінарного дослідження, виконаного спільно співробітниками Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна та Інституту органічної хімії НАН України і присвячена аналізу дії деяких каліксаренметиленбісфосфонових кислот (циклічних олігомерів фенолів) на два добре відомих біохімічних процеси: Mg<^>2+-залежний ензиматичний гідроліз АТР (що каталізується субфрагментом 1 міозину міометрія) та на полімерізацию фібрину. Молекула калікс[4]арену C-97 має макроциклічну структуру, містить внутрішньоімолекулярну ліпофільну "чашу", яка сформована з чотирьох ароматичних циклів, один з яких на верхньому вінці містить метиленбісфосфонову групу. Зазначений каліксарен, використаний в концентрації 100 мкМ, ефективно інгібує АТРазну активність субфрагмента-1 міозина міометрія (коефіцієнт інгібування <$Eroman I sub 0,5 ~=~83~symbol С~7> мкM). У той же час цей каліксарен спричиняє суттєве (щодо контрольного значення) збільшення величини гідродинамічного діаметра молекули субфрагмента-1, що опосередковано вказує на утворення міжмолекулярного комплексу між каліксареном та голівкою міозину. Результати комп'ютерного моделювання, які було проведено із використанням технології докінгу та методів молекулярної динаміки, вказують на те, що у стабілізації зазначеного молекулярного комплексу суттєве місце належить гідрофобним, електростатичним та <$Epi - pi>-стекінг взаємодіям. Одержані результати, з урахуванням низької токсичності каліксаренів та їх здатності проникати в клітини, можуть бути перспективними для подальшої розбудови високоефективних регуляторів (на рівні АТР-залежної взаємодії актину та міозину) скоротливої активності гладеньких м'язів. Досліджено вплив на полімеризацію фібрину калікс[4]аренів, які містять 2 або 4 метиленбісфосфонові групи на верхньому вінці макроциклу. Найпотужнішим інгібітором виявився камікс[4]арентетрабіс-метиленбісфосфонова кислота (C-192), максимальна швидкість полімеризації фібрину в системі фібриноген+тромбін зменшувалась на 50 % за концентрації каліксарену <$E0,52~cdot~10 sup -6> М (IC50), при цьому молярне співвідношення каліксарену до фібриногену дорівнює 1,7:1. У разі полімеризації фібрину desAB, IC50 М становить <$E1,26~cdot~10 sup -6> М, у той же час молярне співвідношення C-192 до мономерного фібрину дорівнює 4:1. Дипроксикалікс[4]-аренбісфосфонова кислота (C-98) інгібувала плімеризацію фібрину desAB з <$Eroman IC sub 50 ~=~1,31~cdot~10 sup -4> М. Зроблено припущення, що C-192 блокує полімеризацію фібрину шляхом зв'язування із сайтом полімеризації "A" (Aa 17-19), який ініціює формування протофібрил за рахунок "knob-hole" взаємодій. Це припущення підтвреджено за допомогою методу ВЕРХ, який показав утворення комплексу включення за типом "гість - господар" C-192 із синтетичним пептидом Gly - Pro - Arg - Pro, аналогом сайту "A". Подальше підтвердження того, що каліксарен C-192 діє на початкову стадію полімеризації фібрину одержано за допомогою електронного мікроскопа. Встановлено, що за присутності каліксарену в середовищі реакції не фомуються навіть протофібрили. Каліксарен C-192 вдвічі збільшував як протромбіновий час, так і активований частково тромбопластиновий час у нормальній плазмі крові людини за концентрації <$E7,13~cdot~10 sup -5> і <$E1,10~cdot~10 sup -5> M відповідно. Ці експерименти показують, що C-192 є специфічним інгібітором полімеризації фібрину та зсідання крові і може бути використаний для розробки нового класу антитромботичних препаратів.

Нікотинові ацетилхолінові рецептори (нАХР) - це лігандзалежні іонні канали, спочатку відкриті у м'язах та нейронах і у подальшому винайдені в багатьох незбудливих клітинах. Підсумовано результати досліджень, які було проведено у відділі молекулярної імунології протягом останніх десяти років, що стосуються будови і функцій нАХР у B-лімфоцитах і мітохондріях, а також ролі нАХР-специфічних антитіл у розвитку нейродегенеративних захворювань, таких, як хвороба Альцгеймера.

Некодуючі РНК є надзвичайно поширеним класом клітинних РНК. Вони беруть участь у багатьох важливих процесах у клітині - сигналінгу, посттранскрипційному сайленсингу, біосинтезі протеїну, сплайсингу, забезпеченні стабільності геному, подовженні теломер, X-інактивації. Проте сфера активності цих РНК не обмежується посттранскрипційним рівнем, а охоплює також процеси, що змінюють епігенетичну інформацію чи відповідають за її збереження. Некодуючі РНК можуть безпосередньо зв'язуватися з мішенями у ДНК, спричиняючи їх репресію через залучення ДНК-метилтрансфераз та хроматинмодифікуючих ензимів. Ці події є молекулярним механізмом РНК-залежного метилування ДНК. Імовірно, РНК-ДНК-взаємодія є універсальним мехаінізмом ініціації метилування ДНК de novo. Алельне виключення також може здійснюватись за допомогою зазначеного механізму. Це явище буде мати місце у тому разі, коли некодуюча РНК, попередник якої транскрибується з одного алеля, спричиняє метилування ДНК усіх інших алелів, наявних у клітині. Слід зазначити, що мікроРНК-опосередкований транскрипційний сайленсинг теж нагадує алельне виключення, оскільки і гени мікроРНК, і гени, репресія яких може бути зумовлена цими мікроРНК, містять ділянки з одними і тими самими послідовностями. Можна припустити, що РНК-залежне метилування ДНК і алельне виключення виникли в процесі еволюції з метою протидії активності мобільних генетичних елементів. Імовірно, перешкоди на шляху реактивації дрімаючих мобільних генетичних елементів знімаються внаслідок скорочення і дерегуляції набору клітинних некодуючих РНК, і це веде до нестабільності геному, котра зумовлює старіння та канцерогенез. У процесі X-інактивації метилування ДНК та подальша гетерохроматизація X-хромосоми можуть бути спричинені прямою гібридизацією 5'-кінця довгої некодуючої РНК Xist із ДНК-мішенями у віддалених регіонах X-хромосоми.

Активні форми кисню (АФК) є радикальними і нерадикальними продуктами неповіного відновлення кисню, що функціонують як медіатори редокс-сигналювання і оксидативного стресу залежно від їх рівня в різних субклітинних компартментах. На сьогодні нагромаджено величезний масив даних, які свідчать на користь функціонування АФК як "вторинних посередників" у регулюванні внутрішньоклітинних сигнальних каскадів, залучених до контролю клітинного росту, проліферації, апоптозу, міграції та інвазії клітин. Узагальнено дані стосовно АФК-залежного регулювання компонентів сигнальних мереж, таких як MAPK, PI3K/Akt, PKC, NF-kB, Nrf2, FoxO, HIF-1<$Ealpha> та ролі АФК у канцерогенезі.

За використання принципу "пролінових скоб" в амінокислотній послідовності фібрину виявлено 4 ділянки та синтезовано відповідні їм пептиди: <$Egamma>69NPDESSKPN77, B<$Ebeta>228QPDSSVKPY236, B<$Ebeta>455RPFFPQ460 та A<$Ealpha>195LPSRDRQHLPL205. За допомогою методів турбідиметричного аналізу й електронної мікроскопії показано, що синтетичний пептид A<$Ealpha>195-205 специфічно інгібує стадію формування протофібрил фібрину, а пептид <$Egamma>69-77 - стаідію латеральної асоціації протофібрил. Одержані результати надають змогу припустити, що в досліджуваних амінокислотних послідовностях фібрину розташовані сайти, які беруть участь у процесах полімеризації.

Встановлено, що активність сироваткових поліреактивних імуноглобулінів (ПРІГ) змінюється з віком у практично здорових людей віком 25 - 70 років. При цьому найбільше (приблизно в 3 - 4 рази) змінюється активність сироваткових IgG ПРІГ в бік збільшення, тоді як активність IgM ПРІГ, навпаки, не підвищується, а іноді з віком навіть знижується. Активність сироваткових IgA ПРІГ варіює значно більше, ніж активність IgG ПРІГ, і до того ж активність IgА ПРІГ набагато менше залежить від віку, ніж IgG ПРІГ. Вікові зміни активності сироваткових ПРІГ у людей, що належать до різних класів імуноглобулінів, можуть свідчити про важливу функціональну роль цих імуноглобулінів, яку ще слід виявити.

Мета роботи - дослідити ефективність синтезованих нітрогенвмісних бісфосфонатів як перспективних субстанцій лікарських засобів у корекції порушень мінерального обміну за остеопорозу. Дослідження проводили на моделі аліментарного остеопорозу у щурів, розвиток якого характеризується гіпокальціємією, гіпофосфатемією, зниженням вмісту 25-гідроксивітаміну D3 у сироватці крові та вираженою демінералізацією кісткової тканини (знижується зольність і вміст мінеральних компонентів). Встановлено, що досліджувані синтезовані нітрогенвмісні бісфосфонати (піразолвмісні аналоги), подібно до препаратів порівняння - метиленбісфосфонату (динатрієвої солі метиленбісфосфонової кислоти) та алендронату (4-аміно-1-гідроксибутиліден-бісфосфонату), з різною ефективністю гальмують процес демінералізації кісткової тканини та посилюють мінеральний обмін у щурів з остеопорозом. Зокрема, за дії досліджуваних препаратів (бісфосфонати І-12, І-40 та І-42) зростав вміст кальцію, фосфатів і знижувалась активність лужної фосфатази та її ізоензимів у сироватці крові. Підвищувалися зольність та вміст кальцію і фосфору в золі великогомілкової та стегнової кісток. Найвищу антирезорбтивну ефективність і здатність корегувати мінеральний обмін за аліментарного остеопорозу, в тому числі й вищі за аналогічні показники препаратів порівняння, продемонстровано для бісфосфонату І-12. Виявлене суттєве зниження вмісту 25-гідроксивітаміну D3 у сироватці крові характеризує значний дефіцит вітамін D3 за аліментарного остеопорозу, що не компенсується бісфосфонатами, а тому подальші дослідження мають бути спрямовані на поєднане застосування бісфосфонатів, які пригнічують активність остеокластів і зменшують резорбцію, та вітаміну D3 - основного регулятора процесу ремоделювання кісткової тканини та активатора остеосинтезу.

Цель работы - конструирование экспрессионного вектора, кодирующего флуоресцентный сенсор пероксида гидрогена, слитого с адаптерным протеином Ruk/CIN85, выяснение его субклеточной локализации и способности детектировать H2O2. Установлено, что во временно трансфицированных клетках HEK293 и MCF-7 Ruk/CIN85-HyPer концентрируется в "дот"-подобных везикулярных структурах разных размеров, в то время как HyPer распределен в клетке диффузно. С использованием прижизненной флуоресцентной микроскопии было продемонстрировано возрастание концентрации H2O2 в репрезентативных везикулярных структурах в течение указанного времени эксперимента. Таким образом, полученная генетическая конструкция, кодирующая химерный протеин Ruk/CIN85-HyPer, является новым инструментом для исследования локализованной продукции H2O2 в живых клетках.

Розглянуто проблему схожості та відмінностей між натуральними антитілами (НАт) і поліреактивними імуноглобулінами (ПРІГ), які здатні перехресно взаємодіяти з деякими неспорідненими антигенами. Аналіз механізмів неспецифічної взаємодії з антигенами ПРІГ і НАт свідчить про те, що між цими субстанціями є суттєві відмінності, які надають можливість класифікувати ці субстанції як різні типи імуноглобулінових молекул. До основних відмінностей між ПРІГ і НАт можна віднести як механізми зв'язування вказаних імуноглобулінових молекул з антигенами, так і афінність цього зв'язування, а також зовсім відмінний вплив деяких низькомолекулярних речовин на ефективність їх взаємодії з антигенами. На підставі одержаних даних можна припустити, що оскільки ПРІГ і НАт принципово відрізняються за властивостями, то вони, мабуть, виконують не тільки схожі, а й відмінні функції імунної системи.