Зазначено, що основний фактор росту фібробластів (bFGF, відомий також як FGF-2) є важливим модулятором клітинної диференціації, проліферації, міграції, ангіогенезу у клітинах різного типу. Рекомбінантний bFGF людини розглянуто як потенційний засіб для лікування судинних і деяких інших захворювань. Розроблено систему біосинтезу bFGF людини (146 амінокислотних залишків) у клітинах E. coli і його очищення. Метод одержання рекомбінантного білка передбачає інфікування фагом <$E lambda> клітин BL21 (DE3), які несуть плазміду з цільовим геном під контролем промотору фага T7. Цей процес закінчується лізисом клітин штаму-продуцента; синтезований bFGF вивільняється в культуральне середовище, де накопичується в розчинній формі (біля 60 мг/л). Цільовий білок очищено, використовуючи афінну хроматографію на гепарин-сефарозі, до гомогенності не менше 98 %. У біологічних тестах показано, що одержаний bFGF стимулює ангіогенез у хоріоалантоїдній мембрані курячих ембріонів.

Досліджено вплив різних джерел вуглецю на синтез рекомбінантного альфа-2 інтерферону людини (ІФН) клітинами E. coli SG30 (plF-16). Установлено, у процесі культивування продуцента за температури 37 <$E symbol Р >C вихід рекомбінантного білка збільшується у разі додавання до поживного середовища гліцерину, рамнози, фруктози, сорбіту, а зменшується - за наявності в середовищі глюкози, мальтози, манніту, ксилози. Виявлено, що негативний вплив цих речовин носить температурозалежний характер і супроводжується різким зниженням pH культурального середовища. Обговорено можливі механізми впливу джерел вуглецю у культуральному середовищі на синтез рекомбінантного білка в клітинах E. coli.

Вивчено вплив гліцерину на вихід і розчинність рекомбінантного білка в модельній системі суперсинтезу метіонінамінопептидази (МАР) Е. coli з використанням РНК-полімерази фага Т7. Виявлено, що гліцерин у складі багатого поживного середовища може пригнічувати ріст штаму-продуцента, сприяти накопиченню цільового продукту в розчинній формі та впливати на його вихід. Показано, що маніпулювання такими параметрами, як концентрація гліцерину й оптична густина культури, в разі якої його вносять у середовище, дозволяє цілеспрямовано підвищувати вихід МАР у розчинній формі. Розроблені в даному дослідженні підходи можна використовувати для одержання інших рекомбінантніх білків у клітинах Е. coli.

Біосинтез альфа-2b інтерферону людини (ІФН) у клітинах Е. coli BL21 (DE3), які несуть плазміду <$E рЕТ~-~аІФН>, індуковано різними (від 0,01 до 10 мМ) концентраціями ізопропіл-<$E beta>-D-тіогалактозиду (ІПТГ). Плазміда <$E рЕТ~-~ аІФН> містить штучний ген ІФН під контролем промотора гена 10 фага Т7. Ген РНК-полімерази фага Т7 знаходиться в хромосомі клітин Е. coli BL21 (DE3) під контролем lac-UV5 промотора Е. coli. Виявлено, що значення мінімальної концентрації ІПТГ, яка забезпечує ефективну експресію цільового білка, зростають із зниженням температури культивування продуцента після індукції. Так, за температури 37 <$E symbol Р>C повна індукція досягається внесенням до середовища ІПТГ у кінцевій концентрації 0,06 мМ, а за температури 21 <$E symbol Р>С - 0,1 мМ. Показано, що зниження концентрації індуктора до 0,01 мМ не сприяє накопиченню ІФН у розчинній формі під час культивування продуцента за температури 37 <$E symbol Р>C. Також визначено, що ІПТГ у кінцевій концентрації до 2 мМ не чинить негативного впливу на літичний розвиток бактеріофага лямбда й інфіковані їм клітини, що містять плазміду, лізуються, в результаті чого рекомбінантний білок у розчинній формі накопичується безпосередньо в культуральному середовищі. Мінімальна концентрація ІПТГ, яка забезпечує максимальний вихід ІФН у цьому способі його одержання, складає 0,2 мМ.

Досліджено вплив на рівень синтезу альфа-2b інтерферону (ІФН) людини в клітинах E.coli SG30 (pIF-16) наявності в поживному середовищі глюкози та мальтози, а також температури культивування продуцента. Продуцент ІФН містить плазміду pIF-16, яка несе тандем штучних генів ІФН. Конститутивну експресію цих генів забезпечує тандем триптофанових промоторів. У результаті досліджень виявлено, що у разі вирощування клітин E.coli SG30 (pIF-16) за температури 37 <$E symbol Р>C у середовищі, що містить як джерела вуглецю мальтозу або глюкозу, може суттєво знижуватися рівень виходу ІФН у порівнянні з середовищем без додавання цих цукрів. Показано, що вихід ІФН залежить від температури культивування продуцента та концентрації даних цукрів у поживному середовищі. Глюкоза виявляє негативний вплив на синтез ІФН у нижчих концентраціях, ніж мальтоза. Встановлено, що додавання мальтози до культурального середовища забезпечує більш високий вихід біомаси, ніж додавання глюкози, у разі вирощування клітин штама-продуцента E.coli SG30 (pIF-16) за температур 37 та 28 <$E symbol Р>C.

Розроблено ефективну технологію одержання розчинного альфа-2b інтерферону людини (ІФН) з використанням системи експресії на основі РНК-полімерази фага Т7. Синтезований для цього штучний ген ІФН клонували в експресійний вектор pET-24a, який містить Т7 промотор і термінатор. Рекомбінантну плазміду, позначену як pET-aІФН, трансформували в клітини E. coli BL (DE3) і синтез ІФН індукували ізопропіл-<$E beta>-D-тіогалактозидом. Вивчено вплив температури (37 и 21 <$E symbol Р>C ) культивування клітин Е. coli BL (pET-aІФН) на рівень синтезу та вихід розчинного ІФН. Встановлено, що рівень синтезу рекомбінантного білка у перші години після індукції за температури 37 <$E symbol Р>C вищий, ніж за 21 <$E symbol Р>C. Так, через 4 год після індукції вихід ІФН у р культивування продуцента за 37 <$E symbol Р>C складає до 20 %, а у разі 21 <$E symbol Р>C - лише 7 % від сумарних білків клітини. Однак, якщо ІФН експресується за температури 37 <$E symbol Р>C, то він накопичується в клітинах у вигляді нерозчинних тілець-включень. Показано, що зниження температури культивування продуцента після індукції сприяє накопиченню цільового білка в розчинній формі. Збільшення тривалості культивування продуцента за температури 21 <$E symbol Р>C до 18 год дозволяє одержувати розчинний ІФН у більшій кількості. Розроблено технологію одержання ІФН, яка передбачає інфікування фагом лямбда клітин E. coli BL21 (DE3), які містять плазміду з цільовим геном під контролем промотора фага Т7. В результаті лізису клітин штамма-продуцента синтезований цільовий білок вивільняється у середовище для росту, де й накопичується у розчинній формі.

За оптимальних умов культивування 1 л фаголізату містить біля 200 мг розчинного ІФН. Одержаний вихід ІФН більш ніж у 2,5 рази вищий у порівнянні з раніше досягнутим виходом розчинного ІФН у разі використання як продуцента клітин E. coli SG30 (pIF-16), що несуть плазміду з двома копіями, штучного гена ІФН під контролем тандема триптофанових промоторів.

Відзначено, що метіонінамінопептидази (МАР) відіграють важливу роль у процесінгу білка. Вони вибірково видаляють N-кінцевий метіонін у поліпептиду як в еу-, так і прокаріотичних клітинах. Однак, за отримання гетерологічних білків у бактеріях додатковий N-кінцевий метіонін часто не відщеплюється. Якщо рекомбінантні білки передбачається застосовувати у клініці, то дуже важливо, щоб кінцевий продукт був ідентичним природному аналогу, інакше в нього можуть бути антигенні властивості. Тому додатковий N-кінцевий залишок метіоніну бажано видалити, що можна здійснити in vitro, обробивши рекомбінантний білок препаратом очищеної МАР E. coli. Розроблено ефективний метод одержання даного ферменту з використанням системи експресії на основі РНК-полімерази фага Т7. Показано, що під час культивування продуцента MAP BL (pET-MAP) за температури 37 <$E symbol Р>C цільовий білок накопичується переважно в нерозчинній формі з виходом 17 % від сумарних клітинних білків. Однак, якщо клітини штаму-продуцента інфікувати фагом лямбда, то одержаний лізат буде вміщувати МАР у розчинній формі в значно більшій кількості, ніж неінфіковані клітини. В результаті оптимізації таких параметрів, як оптична густина культури в разі зараження та наступна температура культивування продуцента, досягнуто вихід цільового білка в кількості, що перевищує 40 % від розчинних білків, або 0,8 г/л. Рекомбінантний білок очищено з використанням іонообмінної хроматографії до гомогенності більше 90 %.

Наведено результати тестування фенотипового прояву метаболізму клітин штаму E. coli BL21 (DE3), зокрема, таких властивостей, як ріст, кислото- та газоутворення у разі вирощування у середовищах, що містять 13 різноманітних джерел вуглецю. Показано, що клітини BL21 (DE3) неспроможні утилізувати цукрозу й інозит. Серед метаболізуючих джерел вуглецю найменший рівень кислотоутворення спостережено у разі вирощування даної культури у середовищі з гліцерином.

Досліджено експресію альфа-2Ь інтерферону (ІФН) людини в різних штамах Е. соli, що несуть одну й ту саму рекомбінантну плазміду pIF-16. Виявлено, що рівень синтезу ІФН в різних штамах Е. соli коливається від рівня, який не визначається електрофоретично, до 35 % від сумарних білків клітини за однакових умов культивування продуцентів. Показано відсутність зв'язку між рівнем синтезу ІФН і генетичною нестабільністю плазмід.

Індекс рубрикатора НБУВ: Е40*871

Рубрики:

Загальна мікробіологія

Шифр НБУВ: Ж21341/а Пошук видання у каталогах НБУВ