Получен препарат растительного происхождения, который характеризуется высокой концентрацией омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (64 %). Исследовано влияние препарата на деятельность и структуру изолированного сердца крысы в условиях ишемии-реперфузии при использовании его в качестве пищевой добавки к повседневному рациону животных в течение четырех недель до осуществления эксперимента. Показано протекторное действие препарата, содержащего омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты на структуру кардиомиоцитов, а также функциональные показатели деятельности изолированного сердца, подверженного воздействию ишемии-реперфузии.

В експериментах на наркотизированных собаках в условиях, максимально приближенных к физиологическим (сохранение целостности грудной полости, естественного дыхания), показано, что моделирование острой ишемии (1,5 ч) и реперфузии (3 ч) миокарда сопровождается реципрокными изменениями активности оксидазотсинтази и аргиназы в ишемизированном миокарде. Активность NOS уменьшалась на 60 %, а активность аргинази повышалась на 487 %. Содержание продуктов обеих альтернативных путей метаболизма L-аргинина также изменялись реципрокно (содержание NO₂^- понизилось на 57 %, а мочевины, наоборот повышалось 665 %). Аналогичные по направленности изменения пулов NO₂^- и мочевины имели место и в артериальной крови, начиная с 10-минутной ишемии миокарда. Обсуждены важные механизмы направленности и последствия этих изменений.

В исследованиях на наркотизированных собаках с использованием метода ретроградной катетеризации одной из ветвей левой коронарной артерии показано, что ингибирование продукции NO приводит к резкому усилению нарушений коронарного кровообращения и показателей гемодинамики (минутный объем крови, общее периферическое сопротивление) при локальной ишемии - реперфузии миокарда по сравнению с контролем. Впервые показано, что ингибирование NOS активизирует процессы аутофагической деструкции кардиомиоцитов в ишемизированной зоне, что в значительной степени может уменьшать площадь функционально активного миокарда. В то же время введение L-аргинина корректировало нарушения кардио- и гемодинамики, что существенно улучшало течение ишемии - реперфузии и уменьшало ультраструктурные изменения в миокарде, а также предупреждало развитие аутофагии.

В экспериментах на изолированных сердцах крыс исследовано влияние модификации жирнокислотного состава фосфолипидов клеточных мембран при помощи <$E omega>-3 полиненасыщенных жирных кислот на характер адренергических реакций миокарда и перекисные процессы при остром иммобилизационном стрессе. Показано, что у животных с модифицированными мембранами при стрессе уменьшаются ультраструктурные изменения миокарда, ингибируются свободнорадикальные реакции, а также значительно снижаются адренергические реакции сердца.

В экспериментах на изолированных неонатальных кардиомиоцитах крысы показано, что при моделировании аноксии - реоксигенации наблюдаются различные типы клеточной гибели: незапрограммированная (онкоз) и запрограммированная (апоптоз и аутофагическая клеточная смерть). При окраске пропидиум йодидом и бис-бензимидом соотношение живых, некротических и апоптотических клеток при аноксии - реоксигенации составляло 77 %, 14 %, 9 % соответственно (в контроле - 86 %, 9,6 % и 4,4 %). Електронно-микроскопические исследования неонатальных кардиомиоцитов после аноксии - реоксигенации позволили выявить морфологические особенности каждого из видов клеточной смерти. Аутофагическая деструкция клеток подтверждались специфической флюоресценцией монодансилкадаверина в вакуолярных образованиях кардиомиоцитов. Полученные результаты впервые указывают на наличие аутофагической клеточной смерти неонатальных кардиомиоцитов при аноксии - реоксигенации и обуславливают необходимость исследования ее роли в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний.

В кардиодифференцированных клетках линии P19 эмбриональной карциномы мыши при помощи метода patch-clamp идентифицирован "быстрый" калиевый ток задержанного выпрямления (IKr). Индукция кардиомиоцитарной дифференциации осуществлена путем культивирования клеток P19 при наличии диметилсульфоксида (1 %), а критериями ее адекватности служили: развитие спонтанной сократительной активности, характерные изменения морфологии, увеличение количества митохондрий, локализованных вблизи сократительных элементов, экспрессия мРНК кардиоспецифического актина и легких цепей миозина, а также наличие входящих натриевого и кальциевого токов. Идентификация IKr произведена на основе чувствительности к специфическому антагонисту Е-4031, который в концентрации 1 мкмоль/л блокировал около 50 % суммарного выходящего калиевого тока. Однако в отличие от IKr в нативных кардиомиоцитах и гетерологических системах, експрессирующих калиевые каналы ether-a-go-go(eag)-related gene (ERG1), которые за него ответственны, E-4031-чувствительный компонент калиевого тока в кардиомиоцитдифференцированных клетках (КМДК) P19 не обнаруживал характерного внутреннего выпрямления, что, вероятно, является следствием специфической регуляции и/или субъединичного состава эндогенных ERG1-основанных каналов в этих клетках. Дальнейшие исследования обнаруженного феномена отсутствия выпрямления E-4031-чувствительного компонента калиевого тока может содействовать открытию новых механизмов, которые его определяют. КМДК Р19 могут также послужить удобной in vitro

моделью для изучения фармакологической регуляции IKr, который, как известно, является основной мишенью побочного кардиотоксического действия многих клинически используемых препаратов.

New stents having porous surface for filling with medication have been developed. Surface has extra rigidity in radial direction and sufficient flexibility in longitudinal direction. Corvitin developed in A. A. Bogomoletz Institute of Physiology of NASU is offered as filler.

Моделируя "стресс эндоплазматического ретикулума" (ЭР) с помощью его классического индуктора тапсигаргина, установлены специфические ультраструктурные признаки, сопоставление которых с изменениями при аноксии-реоксигенации и одновременном подавлении протеасомного протеолиза, аутофагии и апоптоза, позволяет сделать вывод о том, что они имеют общие, характерные для стресса ЭР, черты. Под влиянием тапсигаргина в части кардиомиоцитов наблюдалось скопление в околоядерной зоне митохондрий большого размера (так называемых гигантских митохондрий), внутренние мембраны которых в основном сохраняли свою структуру, однако в некоторых органеллах матрикс разрушен или повышенно конденсирован. Структура ЭР была близкой к норме, и только в отдельных локусах клеток отмечалось незначительное расширение его цистерн, что является первым признаком стресса ЭР. В другой группе клеток тапсигаргин приводил к дегидратации и осмиофилии цитоплазмы, существенному уменьшению размеров и количества митохондрий, значительному расширению цистерн ЭР, частичной или полной дегрануляции этих органелл, которые часто образовывали вакуоли, наполненные электронно-плотным материалом. Кроме того, в этих клетках отмечалось накопление липофусцина и разрушение миофиламентов при сохранении целостности цитоплазматической мембраны. Одновременное подавление протеасомального протеолиза, аутофагии и апоптоза приводило к аналогичным ультраструктурным изменениям в кардиомиоцитах, но как показали исследования с применением флуоресцентных красителей для выявления апоптоза и некроза, целостность сарколеммы в этих опытах в большинстве клеток

не сохранялась, что неизбежно приводит к некрозу. Проведенные исследования указывают на значение стресса ЭР в процессах гибели кардиомиоцитов при аноксии-реоксигенации, а также в условиях подавления протеасомального протеолиза, аутофагии и апоптоза.

В експериментах на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура встановлено, що у них експресується ген ALOX5, який кодує фермент 5-ліпоксигеназу. Моделювання аноксії - реоксигенації не впливало суттєво на експресію мРНК 5-ліпоксигенази. Введення у кардіоміоцити специфічних до мРНК 5-ліпоксигенази інтерферуючих РНК (siRNA) пригнічувало експресію гена ALOX5 через 24 год культивування у 4,7 рази (<$E p~<<~0,05> у порівнянні з введенням індиферентних РНК). У процесі моделювання аноксії - реоксигенації зниження рівня мРНК 5-ліпоксигенази супроводжувалося збільшенням кількості живих клітин (на 13,3 %, <$E p~<<~0,001>) внаслідок зменшення кількості клітин, що загинули шляхом некрозу (на 14,6 %, <$E p~<<~0,001>). Число апоптотичних клітин у цьому випадку не змінювалося. Одержані результати дозволяють стверджувати, що специфічне пригнічення експресії гена, що кодує фермент 5-ліпоксигеназу, за допомогою інтерферуючих РНК здійснює цитопротективний ефект за аноксії - реоксигенації кардіоміоцитів.

В экспериментах на изолированном, перфузированном по Лангендорфу, сердце морской свинки с моделированием ишемии (20 мин) и реперфузии (40 мин) показано кардиопротекторные эффекты фторсодержащего активатора АТФ-зависимых калиевых (КАТФ) каналов флокалина. С помощью блокатора митохондриальных КАТФ-каналов 5-гидроксидеканоиновой кислоты (200 мкмоль/л) определена относительная роль в этих эффектах активации сарколеммальных и митохондриальных КАТФ-каналов. Предварительная предишемическая перфузия изолированного сердца флокалином (5 мкмоль/л) в течение 5 мин значительно улучшала восстановление сократительной функции ишемизированного миокарда при реперфузии, в частности, восстановление систолического и развивающегося давления, и предотвращала повышение конечно-диастолического давления в левом желудочке, а также вазоконстрикцию коронарных сосудов и значительно уменьшала экстрасистолию при реперфузии ишемизированного сердца. Морфологические исследования показали, что флокалин предотвращает значительное повреждение структуры миокарда и развитие необратимых некротических процессов при ишемии-реперфузии миокарда и способствует сохранению целостности сарколеммы и структуры внутриклеточных органелл, а также деструкцию митохондрий, что способствует сохранению энергетического потенциала миокарда.

Исследована экспрессия генов и механизмы клеточной смерти при моделировании двух эпизодов аноксии - реоксигенации на первичной культуре изолированных неонатальных кардиомиоцитов. Культуру клеток подвергали действию 30-минутной аноксии с последующей реоксигенацией в течение 24 ч (А - Р1) и повторной аноксии - реоксигенации продолжительностью 30 - 60 мин соответственно (А - Р2). Процент живых, некротических, апоптотических и аутофагических кардиомиоцитов определяли окрашиванием клеток флуоресцентными красителями бис-бензимидом, йодид пропидиумом и монодансилкадаверином соотвественно, с помощью метода флуоресцентной микроскопии. Аноксия - реоксигенация существенно влияла на соотношение указанных клеток как при А - Р1, так и при А - Р2. Показано, что основным механизмом гибели клеток при моделировании А - Р1 и А - Р2 является некроз. Установлены изменения экспрессии генов белков теплового шока HSP70 и HSP90, антиапоптотического белка Bcl2 и ключевого регулятора аутофагии FRAP (от англ. FKBP-rapamycin associated protein). Полученные результаты позволяют предположить, что в культуре кардиомиоцитов через сутки после первой аноксии повышенная экспрессия белков теплового шока запускает каскад реакций, которые обусловливают некротическую гибель клеток и блокирование апоптотической программы при А - Р2.

У дослідах на анестезованих собаках з відтворенням експериментальної ішемії (90 хв) та реперфузії (180 хв) показано кардіопротекторний вплив фармакологічного прекондиціювання, викликаного введенням лікарської форми (таблетки) фторвмісного активатора аденозинтрифосфат (АТФ)-чутливих калієвих (KАТФ) каналів - флокаліну за допомогою зонда в середину шлунка. Вибрана доза 2,2 мг/кг за умов фізіологічної норми мала мінімальний вплив на показники кардіогемодинаміки. Проведене дослідження дало змогу визначити зміну цих показників під час розвитку захисного антиішемічного механізму фармакологічного прекондиціювання та окреслити основні кардіопротекторні реакції, пов'язані зі змінами в кардіогемодинаміці у випадку ішемії - реперфузії міокарда. До позитивних впливів флокаліну, що можуть сприяти його кардіопротекторним ефектам, можна віднести попередження реперфузійного підвищення загальнопериферичного опору та опору коронарних судин серця, а також помірне зниження артеріального тиску, що послаблює навантаження на уражене серце і сприяє збереженню серцевого викиду в перші години ішемії. Позитивним можна також вважати відносне збереження показників скоротливої активності міокарда в період реперфузії. Одним із найвагоміших показників розвитку захисного механізму фармакологічного прекондиціювання у разі передішемічного введення лікарської форми флокаліну є зменшення розміру некротичної ділянки міокарда, а, отже, зони інфаркту, в експериментах з ішемією - реперфузією міокарда у порівнянні з контролем на 43 %.

Беручи до уваги важливу роль убіквітинзалежного протеасомного протеолізу в обміні функціональних білків кардіоміоцитів (актину, міозину, іонних каналів тощо), становить інтерес дослідження механізмів клітинної смерті при специфічному заглушенні гена убіквітину (UBB) за допомогою РНК-інтерференції та моделюванні аноксії-реоксигенації. Інтерферуючі РНК вводили шляхом електропорації в ізольовані неонатальні кардіоміоцити, після чого первинна культура клітин підлягала дії аноксії (30 хв) з наступною реоксигенацією (1 або 24 год). Відсоток живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів визначали флуоресцентною мікроскопією. Кількісну оцінку експресії UBB і субодиниць протеасоми <$E beta>5 (PSMB5) та <$E beta>9 (PSMB9) проводили з використанням полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Показано, що при моделюванні аноксії-реоксигенації в режимі 30 хв - 24 год експресія мРНК UBB збільшувалася в 2,1 раза. При введенні в культуру малих інтерферуючих РНК експресія мРНК цього білка зменшувалася в 2,4 раза, при цьому знижувалася експресія мРНК субодиниць протеасоми <$E beta>5 і <$E beta>9 в 1,3 та 1,6 раза відповідно в порівнянні з контролем (введення індиферентних дволанцюгових РНК). При цьому зменшувалася кількість живих клітин у культурі, збільшувалася кількість некротичних, апоптотичних і клітин з ознаками аутофагії. При цьому заглушення UBB при аноксії-реоксигенації (30 хв - 1 год) збільшувало кількість живих клітин на 3,7 % і зменшувало кількість некротичних кардіоміоцитів на 4,7 % та не впливало на популяцію апоптотичних та аутофагічних клітин. Одержані результати свідчать про те, що заглушення UBB, експресія як

ого збільшується при аноксії-реоксигенації, індукує некротичну та аутофагічну загибель інтактних культивованих кардіоміоцитів, однак деякою мірою збільшує резистентність цих клітин до аноксії-реоксигенації.

В експериментах на анестезованих собаках з відтворенням експериментальної ішемії (90 хв) та реперфузії (180 хв) показано кардіопротекторний вплив доішемічної активації АТФ-чутливих калієвих (КАТФ) каналів за допомогою внутрішньовенного введення нового вітчизняного фторвмісного активатора цих каналів - флокаліну в дозі 0,1 мг/кг, що практично не змінювало показники гемодинаміки за умов нормоксії. Таким чином, проведене дослідження впливу флокаліну на зміни кардіогемодинаміки під час ішемії-реперфузії міокарда продемонстрували певні особливості розвитку ішемічно-реперфузійного синдрому за умов стимуляції активності КАТФ-каналів. З точки зору до позитивних впливів флокаліну, що можуть сприяти його кардіопротекторним ефектам, можна віднести помірне зниження артеріального тиску, що послаблює навантаження на уражене серце і сприяє збереженню серцевого викиду в перші години ішемії, запобігання підвищенню опору коронарних судин та відносне збереження показників скоротливості міокарда в період реперфузії. Всі вищеперераховані властивості флокаліну сприяють зменшенню розміру зони інфаркту міокарда після ішемії-реперфузії у порівнянні з контролем на 37 %.

В експериментах на щурах з тривалою активацією (протягом місяця) <$E beta>-адренергічних рецепторів досліджено комплекс структурно-функціональних перебудов міокарда. Встановлено істотне послаблення насосної функції міокарда: зниження ударного об'єму на 38,50 % (<$E P~<<~0,01>), хвилинного об'єму крові - на 42,38 %, фракції викиду - на 35,61 % (<$E P~<<~0,01>). Разом з тим підвищувалися кінцево-діастолічний тиск лівого шлуночка (у 2 рази, <$E P~<<~0,01>) та константа активного розслаблення (на 12,91 %, <$E P~<<~0,01>). Ці зміни свідчать про наявність діастолічної дисфункції серця, розвиток якої пов'язаний з накопиченням сполучнотканинних елементів у міокарді та збільшенням його кінцево-діастолічної жорсткості, що в результаті може призвести до порушень насосної функції серця. Досить неочікуваним виявився факт значного зростання скоротливості міокарда не тільки після застосування агоніста <$E beta>-адренорецепторів, але й через 26 діб після його відміни. Про це свідчить збільшення максимальної швидкості приросту тиску на 49,9 %, а також кінцево-систолічної та максимальної жорсткості міокарда у 2,5 разу та на 42,53 % відповідно. Цей феномен можна пояснити компенсаторним збільшенням скоротливої функції міокарда за даних умов, але вона виявляється недостатньою для підтримання адекватної насосної функції серця та, більше того, може призводити до виснаження енергетичних ресурсів серця.

Зважаючи на значну роль убіквітин-залежного протеасомного протеолізу (УПП) у регуляції кількості білків, що контролюють запрограмовану клітинну смерть (апоптоз та аутофагію), метою роботи було дослідження здатності кардіоміоцитів до виживання при специфічному приглушенні генів убіквітину (UBB) та ключової для збірки протеасоми субодиниці <$E beta 7> (PSMB7). Застосовано методи РНК-інтерференції (для приглушення генів UBB і PSMB7), флуоресцентної мікроскопії та полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі. Показано, що приглушення генів UBB і PSMB7 знижує їх експресію в 2,4 (<$E p~<<~0,05>) та 1,6 разу (<$Ep~>>~0,05>) відповідно, в разі цього зростає кількість некротичних клітин без зміни рівня апоптичних. Кількість клітин з ознаками аутофагії значно збільшується за рахунок порушення УПП і накопичення великої кількості внутрішньоклітинних білків, які деградують внаслідок лізису. Одержані дані свідчать про те, що приглушення генів UBB і PSMB7 індукує загибель кардіоміоцитів через некроз та аутофагію, не впливаючи на кількість апоптичних клітин.

Досліджено протеолітичну активність протеасоми у тканинах аорти та серця щурів зі спонтанною гіпертензією (лінія SHR), а також застосовано кверцетин, що здатний пригнічувати цей мультикаталітичний комплекс. Під час визначення активності протеасоми в аорті щурів лінії SHR суттєвих відмінностей у порівнянні зі щурами лінії Вістар не встановлено. Проте у тканинах серця виявлено суттєво менші значення трипсино- (на 40 %, P >> 0,05), та хімотрипсиноподібної (в 1,1 раза, P << 0,05) активності. Одночасно у щурів лінії SHR виявлено значні морфологічні зміни (фіброз 4,7 % від площі лівого шлуночка, більший індекс маси серця на 21,6 %, а також збільшення товщини інтими в аорті та ширини шарів гладеньком'язових клітин). Відмічалися функціональні порушення діяльності серця: зниження таких показників, як ударний об'єм утричі (P << 0,0001), фракція викиду в 2,5 раза (P << 0,0001) і підвищення кінцево-діастолічного тиску в 6,5 раза (P << 0,005) та кінцево-систолічного тиску на 15 % (P << 0,004). Кверцетин ефективно пригнічував трипсино- і хімотрипсиноподібну активність протеасоми в аорті в 2,7 раза (P << 0,005) та вдвічі (P << 0,003) відповідно, а також трипсино- (в 2,4 раза, P >> 0,05) і каспазоподібну (в 9,3 раза, P << 0,015) активність у серці, що призвело до значного покращання морфофункціональних показників діяльності серця. Оскільки препарати кверцетину досить широко використовуються у клінічній практиці (особливо у випрадку гострого інфаркту), можна рекомендувати їх для запобігання ремоделювання серця у разі підвищення артеріального тиску.

Зміни активності внутрішньоклітинних протеолітичних систем - важлива ланка в механізмах атеросклеротичного пошкодження судинної стінки й артеріальної гіпертензії (АГ). Однією з мало вивчених гігантських протеаз є трипептидил-пептидаза (ТПП) II, що забезпечує гідроліз пептидів, які утворюються після протеасамного протеолізу. В експериментах з моделювання холестеринового атеросклерозу у кролів (протягом 2 міс одержували корм зі 1 %-м вмістом холестирину) встановлено суттєве зниження (на 64 %, P << 0,05) активності ТПП II у тканинах аорти. Показано, що холестеринова дієта зі спонтанною гіпертензією щурів також знижує активність дослідженої протеази (на 50 %, P << 0,05), яка у щурів лінії Вістар не змінювалася. Застосування препаратів кверцетину запобігало пригніченню активності в тканинах аорти кролів за умов експериментальній гіперхолестеринемії та у щурів лінії SHR. Одержані результати свідчать, що зміни активності ТПП II призводять до ушкодження судинної стінки у разі атеросклерозу й АГ.

Презентовано дані про обмеження експресії некаталітичної протеасомної субодиниці <$E beta 7> (PSM<$E beta 7>) за допомогою методу РНК-інтерференції. За допомогою біохімічного та генетичного методів встановлено, що обмеження гена PSM<$E beta 7> в кардіоміоцитах призводить до зниження експресії субодиниці <$E beta 7> в 16 разів. Це спричинює як двократне зменшення експресії мРНК <$E beta 1>-субодиниці протеасоми, так і зниження її активності (пептидилглутаміл пептид-гідролазної) на 72 % (<$E 0,48~symbol С~0,2> нМ АМК/хв) у порівнянні з контролем (<$E 1,7~symbol С~0,5> нМ АМК/хв, <$E Р~<<~0,05>); в цьому разі знижується експресія мРНК каталітичної <$E beta 5>-субодиниці (у 21 раз, <$E Р~<<~0,05>) без зміни її протеолітичної хімотрипсиноподібної активності, а також активності трипсиноподібної <$E beta 2>-субодиниці. Рівень мРНК індуцибельної субодиниці протеасоми PSM<$E beta 9> також залишається без змін. Активність трипептидилпептидази II не змінюється. Обмеження некаталітичної субодиниці PSM<$E beta 7> специфічно впливає на активність і рівень експресії мРНК каталітичної субодиниці <$E beta 1> та зменшує експресію PSM<$E beta 5>, не впливаючи на її активність.