У процесі взаємодії 2-азагетарилацетонітрилів з хлорангідридом 2-метилсульфоніл-5-хлоро-4-піримідинкарбонової кислоти одержано 2-[2-(метилсульфоніл)-5-хлоро-4-піримідиніл]-2-оксо-1-(2-гетерил)-етилціаніди. Встановлено, що їх взаємодія з амінами та меркаптанами призводить до утворення продуктів регіоселективного заміщення метилсульфонільної групи. Встановлено, що похідна піридину реагує з аліфатичними амінами з утворенням 3-аміно-5-оксо-5H-піримідо[4,5-с]хіназолін-6-карбонітрилів. З'ясовано, що за умови дії третинних амінів 2-[2-(метилсульфоніл)-5-хлоро-4-піримідиніл]-2-оксо-1-(2-гетарил)-етилціаніди циклізуються з утворенням конденсованих піридопіримідинів, а одержані сполуки реагують з N-, O- та C-нуклеофілами, утворюючи похідні за C-3 положенням циклу. Розроблено препаративний метод синтезу невідомих раніше 2-аміно-5-галогено-4-піримідинкарбонових кислот амінуванням 5-галогено-2-метилсульфоніл-4-піримідинкарбонової кислоти. Досліджено взаємодію етил 2-алкілмеркапто-4-хлоро-5-піримідинкарбоксилатів з 2-гетарилацетонітрилами. Вперше ізольовано етил 4-[(2-гетарил)-ціанометил]-2-алкілмеркаптопіримідин-5-карбоксилати - продукти заміщення атома галогену. Показано, що проходження внутрішньомолекулярного ацилювання у першу чергу контролюється основністю, а потім - стеричним оточенням атома азоту гетероциклічного фрагменту.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

Визначено поняття "ономасіологічний клас" як об'єднання одноструктурних одиниць, що мають подібне значення, зумовлене подібністю позначених ними референтів. Вперше здійснено комплексний опис ономасіологічного класу, що включає формальну та номінативну інтерпретацію його компонентів. Наголошено на подібності ономасіологічних моделей різних типів композитних імен, що позначають процесуальність. Проведено визначення реєстру моделей формальної та семантичної структури компонентів ономасіологічного класу. Наведено реєстр типів процесуальності у вигляді класифікації ономасіологічних базисів підкласів розглянутого ономасіологічного класу.

  Скачати повний текст

Дисертацію присвячено дослідженню протеїн фосфатаз, задіяних в регуляції цитоскелету у рослин та вивченню особливостей їх взаємодії зі специфічними інгібіторами. У результаті проведених досліджень було реконструйовано повні фосфатоми рослин, які представлені суперродинами серин/треонін-, тирозин- та аспартат-специфічних протеїнфосфатаз. Відібрано групу рослинних протеїнфосфатаз, пов'язаних з регуляцією структури та функцій мікротрубочок, та реконструйовано тривимірні моделі протеїнфосфатаз людини і представників одно- та дводольних рослин. Встановлено структурно-біологічні особливості взаємодії інгібіторів з протеїнфосфатазами рослин. Оригінальні дані щодо сайтів ліганд-білкової взаємодії розширюють уявлення стосовно механізмів, що обумовлюють селективність відомих інгібіторів протеїнфосфатаз та особливостей їх дії в клітинах вищих рослин та мають значення для подальшого раціонального дизайну сполук з антифосфатазною активністю. Встановлені відмінності спорідненості інгібіторів до різних PP1, PP2A і PP4 рослин дають можливість оптимізувати молекулярний дизайн нових біологічно активних сполук із підвищеною селективністю до зазначених молекулярних мішеней. Висловлено припущення про 5 похідних інгібіторів протеїнфосфатаз з більшим рівнем спорідненості до цільових PP1, PP2A, PP4, які можуть знайти застосування як нові ефективні інгібітори протеїнфосфатаз вищих рослин.^UProtein phosphatases associated with the cytoskeleton regulation in plants are considered in the presented Thesis. Characteristics of their interaction with specific inhibitors are studied. As a result of the research, complete plant phosphatomes, represented with serine/threonine-, tyrosine-, and aspartate-specific protein phosphatase superfamilies, were reconstructed. A group of plant protein phosphatases associated with the microtubules regulation has been selected, models of human protein phosphatase and homolog proteins of monocotyledonous and dicotyledonous plants were constructed. Structural and biological features of interaction between inhibitors and plant protein phosphates were established. The original data on ligand-protein interaction sites extends the view of mechanisms that determine the selectivity of known protein phosphatase inhibitors and peculiarities of their structures in higher plant cells. These data are relevant for the subsequent rational design of compounds with antiphosphatase activity. The established differences in the affinity of inhibitors toward different PP1, PP2A and PP4 plants made it possible to optimize the molecular design of new biologically active compounds with increased selectivity against these molecular targets. 5 derivatives of protein phosphatase inhibitors with a higher levels of affinity to the target PP1, PP2A, PP4 were proposed. It is possible to use the described compounds as new effective inhibitors of protein phosphatase in higher plants.

Здійснено системну оцінку можливості та ефективності застосування однієї з сучасних систем молекулярних маркерів, що базується на наявності інтрон-специфічного поліморфізму ДНК у родині генів β-тубулінів рослин (tubulin-based polymorphism, TBP). Було розглянуто вже раніше набутий досвід і наведено власні приклади використання ТВР-аналізу та його модифікацій (сТВР та hТВР) при дослідженні однодольних та дводольних рослин на між- та внутрішньовидовому рівні, а саме: сортів пальчастого проса (E. coracana) та генотипів гусячої трави (E. indica), кримських популяцій егілопсу (Ae. biuncialis), острівних популяцій щучника антарктичного (D. antarctica), сортів пшениці (T. aestivum) та ячменю (H. vulgare), сортів та сортозразків рижію посівного (C. sativa), видів льону (L. bienne, L. angustifolium, L. usitatissimum, L. humile, L. perenne), різних сортів льону-довгунцю, а також білоруських ландрас льону. Показано високу ефективність використання ТВР-аналізу для диференціації різних генотипів рослин, що може бути вельми корисним як в молекулярній генетиці рослин при аналізі на всіх таксономічних рівнях, так і в селекційній роботі при створенні та перевірці нових сортів, адже ТВР метод поєднує в собі надійність і швидкість отримання вихідних даних, а також простоту їх аналізу.^UIntrons are universal and convenient tool for molecular genetic research in a wide range of organisms because of its length polymorphism. A systematic assessment of the application possibility and effectiveness of one of the modern molecular marker systems based on the presence of an intron-specific DNA polymorphism of the tubulin family in plants (tubulin-based polymorphism, TBP) was carried out in the present work. Because it is not yet widely used, this method requires verification of its effectiveness for genotyping plants at different taxonomic levels. The previous data were reviewed and new application examples of the TBP analysis (TBP method – I intron length polymorphism assessment) and its modifications (сТВР method - II intron length polymorphism assessment, and hТВРmethod – I+II introns length polymorphism assessment) in monocotyledonous and dicotyledonous plants assessment at the interspecies and interspeces level were presented. Following plants were tested: finger millet (E. coracana) varieties and the genotypes of Indian goosegrass (E. indica), Crimean populations of aegilops (A. biuncialis), Antarctica island populations of hair grass (D. antarctica), wheat (T. aestivum) and barley cultivars (H. vulgare); varieties and cultivars of camelina (C. sativa), flax species (L. bienne, L. angustifolium, L. usitatissimum, L. humile, L. perenne), various cultivars of flax and Belarusian flax landraces. Range of amplicon size variation (introns of the tubulin genes) was obtained for all investigated plants, UPGMA-denograms were constructed between populations, varieties and genotypes based on the values of the genetic similarities of Ney and Lee; PIC values (Polymorphism Information Content) were calculated. In addition, a bioinformation analysis of the exon-intron structure of β-tubulin genes in wheat, barley and flax was conducted. To obtain a specific TBP profile of all studied samples, a polymerase chain reaction was performed with known primer sequences and the resulting reaction products were separated using a non-denaturing polyacrylamide gel followed by silver nitrate visualization. The high application efficiency of the β-tubulin gene intron length polymorphism assessment was shown for fingerprinting of various plant genotypes, that can be used both for plant molecular genetics and for purposeful application in molecular selection, for example, during creating and testing new varieties. The obtained results allow us to recommend this β-tubulin gene's intron length evaluation method and its modifications for the molecular genetic differentiation of monocotyledonous and dicotyledonous plant representatives, as well as to offer it for application in molecular genetic research of other plant phylogenetic groups, because this method combines reliability and high output data obtaining speed with data analysis simplicity.

Досліджено роль ацетилювання α-тубуліну при реалізації аутофагії у клітинах A. thaliana, індукованої стресовими факторами абіотичної природи(голодування, осмотичний і сольовий стреси, ультрафіолет В). На морфологічному, транскрипційному та біохімічному рівнях показано розвиток аутофагії у відповідь на дію цих чинників. Встановлено, що інгібування стрес-індукованої аутофагії викликає підвищення кількості клітин у стані програмованої клітинної загибелі, що ілюструє роль аутофагії як адаптивного механізму. Продемонстровано суттєве підвищення рівнів ацетильованого α-тубуліну під впливом абіотичних стресових факторів, а також показано, що ацетилювання α-тубуліну забезпечує більш міцну його взаємодію тубуліну з білком аутофагії Atg8, що підтверджує функціональну роль мікротрубочок у реалізації аутофагії. Встановлені закономірності впливу стресових чинників на експресію генів α-тубуліну та білка atg8 і генів ферментів, залучених до ацетилювання тубуліну (ацетилтрансфераза elp3 та деацетилази hda14 і hda6). Виокремлено рослинні кінезини, вірогідно залучені до розвитку аутофагії та проаналізовано закономірності їх експресії під впливом досліджуваних абіотичних факторів. Встановлено тканиноспецифічний характер ацетилювання α-тубуліну як модифікації, котра у відповідь на вплив абіотичних стресів найбільш виражено проявляється у молодих та меристематичних тканинах, а також у тканинах коренів (кореневому чохлику, епідермісі та перициклі).^UThe role of post-translational acetylation of α-tubulin in the realization of stress-induced autophagy in A. thaliana cells was investigated. It was shown on the morphological, transcriptional and biochemical levels, that the development of autophagy is induced as a response to abiotic stress influence. It was found that an inhibition of stress-induced autophagy causes an intensification of programmed cell death development, which illustrates the role of autophagy as an adaptive mechanism. A significant increase in the level of acetylated a-tubulin was detected under the influence of abiotic stress. Moreover, it was shown that acetylation of α-tubulin provides a stronger interaction of tubulin with Atg8, an autophagy protein, which altogether confirms the functional role of microtubules in the realization of stress-induced autophagy. The regularities of the influence of stress factors on the expression of α-tubulin genes and the atg8, as well as on the enzymes involved in the acetylation of the tubulin (acetyltransferase elp3, deacetylases hda14 and hda6) have been established. The plant kinesins that are likely to be specific for the realization of stress-induced autophagy have been identified and the patterns of their expression under the influence of the abiotic factors were analyzed. Stress-induced α-tubulin acetylation was shown as a tissue-specific modification, which is most pronounced in young and meristic tissues, as well as in root tissues (root cap, epidermis and pericycles).

В дисертації представлено новий підхід для генотипування, що базується на оцінці поліморфізму довжини інтронів генів актину. Вивчено можливість його використання для ДНК-профілювання та диференціації рослин на видовому, популяційному, сортовому та внутрішньосортовому рівнях. Спираючись на результати біоінформатичного пошуку та аналізу генів актину в геномах однодольних та двудольних рослин здійснено дизайн та синтез універсальних ПЛР-праймерів, з використанням яких досліджено поліморфізм довжини інтронів генів актину у представників родин Poaceae, Linaceae, Solanaceae та Brassicaceae. Окрім того, на прикладі внутрішньосортового аналізу льону-довгунця підтверджена ефективність оцінки поліморфізму довжини інтронів генів актину в порівнянні з популярними SSR-маркерами та ТВР-методом. Отримані дані свідчать про те, що розроблений метод оцінки поліморфізму довжини інтронів генів актину є інформативним інструментом для проведення молекулярно-генетичного аналізу рослин, який може знайти застосування в селекційних та популяційно-генетичних дослідженнях.^UA new approach for genotyping based on assessment of the intron length polymorphism of actin genes has been presented in the dissertation. The possibility of its use for DNA profiling and differentiation of plants at the specific, population, varietal and intravarietal levels has been studied. Based on the results of the bioinformation search and actin gene analysis in the genomes of monocotyledonous and dicotyledonous plants, the design and synthesis of universal PCR primers was carried out, using which intron length polymorphism of actin genes in representatives of the families Poaceae, Linaceae, Solanaceae and Brassicaceae was studied. In addition, by the example of flax intravarietal analysis the effectiveness of the approach for assess the intron length polymorphism of actin genes was confirmed in comparison with the popular SSR markers and TBP method. The same efficiency of DNA markers that detect the intron length polymorphism of actin genes compared to SSR markers and higher efficiency compared to the TBP method was established. In general, the data obtained indicate that a new approach for evaluation of the intron length polymorphism of actin genes is the informative tool for the plant molecular genetic analysis, which may find application in breeding and population-genetic studies.

використання у дослідах з поліплоїдизації рослин роду Miscanthus, а саме: 4-метилсульфоніл-2,6-динітроанілін; N′-(N”-[2,6-динітро-4-трифторметилфеніл]пропіл)морфолін; N,N'-біс-(2-нітро-феніл)-гексилен-1,6-диамін; N'-(2,6-динітро-4-За допомогою методів in silico проведено скрінінг ряду новосинтезованих динітроанілінових сполук на спорідненість до α-тубуліну міскантусу. Здійснено реконструкцію та верифікацію просторової структури молекули α-тубуліну міскантусу. Проведено оцінку здатності нових та широко вживаних сполук динітроанілінового ряду утворювати ліганд-білкові комплекси з α-тубуліном, успадкованим від M. sinensis (Q70ZL7). Серед 83 досліджених в роботі динітроанілінів, за критерієм стабільності комплексів з ɑ-тубуліном та рівнем фітотоксичності відібрано 6 найбільш перспективних сполук для подальшого трифторметил-феніл)-етилен-1,2-диамін гідрохлорид; 1-{3-[2-(2,6-динітро-4-трифторметил-феніламіно)-етил ]-4-метил-2-феніліміно-2,3-дигідро-тіазол-5-іл}-етанон гідрохлорид та {2- [4-(2,4-дихлор-феніл)-2-феніліміно-тіазол-3-іл]-етил}-(2,6-динітро-4-трифторметил-феніл)-амін гідрохлорид. Було проведено поліплоїдизацію M. × giganteus шляхом культивування асептичних пагонів в умовах in vitro на середовищах доповнених динітроанілінами. Використовували як наведені вище сполуки, так і референтні динітроаніліни (трифлюралін та оризалін). Встановлено, що досліджувані сполуки, так само як і вже добре відомі, здатні індукувати поліплоїдію M. х giganteus, та не характеризуються високим фітотоксичним впливом на рослини, що істотно позначається на виживанні та мікроклональному розмноженні експлантів. За стандартними методиками проведено вивчення фенотипових особливостей поліплоїдних ліній міскантусу гігантського. Поліплоїдні лінії 108 та 202 характеризувались найкращими показниками маси надземної частини рослин, висоти рослин, кількості ризом на кореневищах рослин, кількості листків на стеблі, за вмістом сухих речовин та виходом біоетанолу завдяки високій продуктивності біомаси.^UIn silico methods were used for screening of a range of newly synthesized dinitroaniline compounds on their affinity to miscanthus α-tubulin. Reconstruction and verification of the spatial structure of miscanthus α-tubulin molecule was performed. The ability of newly synthesized as well as widely used compounds of dinitroanilines class to form ligand-protein complexes with α-tubulin inherited from M. sinensis (Q70ZL7) was evaluated. According to the criterion of stability of the complexes with ɑ-tubulin and phytotoxicity level, among 83 studied, 6 the most promising dinitroanilines were selected for further use in experiments on polyploidization of plants belonging to genus Miscanthus, and namely: 4-methylsulfonyl-2,6-dinitroaniline; N′-(N”-[2,6-dinitro-4-trifluoromethylphenyl] propyl)morpholine; N,N'-bis-(2-nitro-phenyl)-hexylene-1,6-diamine; N'-[2,6-dinitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]ethane-1,2-diamine; hydrochloride; 1-{3-[2-(2,6-dinitro-4-trifluoromethyl- phenylamino)-ethyl]-4-methyl-2-phenylamino-2,3-dihydro-thiazole-5-yl}-ethanol hydrochloride; {2-[4-(2,4-dichlorophenyl)-2-phenylamino-thiazole-3-yl]-ethyl}-(2,6-dinitro-4- trifluoromethyl-phenyl)-amine hydrochloride. Polyploidization of M. × giganteus was conducted by culturing of aseptic shoots in vitro on media supplemented with dinitroanilines. Both, newly synthesized compounds listed above, and widely used dinitroanilines (trifluralin and oryzalin) were used in the work. It was found that newly synthesized dinitroanilines, as well as widely used are able to induce polyploidy of M. x giganteus. Moreover, newly synthesized compounds do not have high phytotoxicity level, which significantly affects the survival rate and micropropagation of explants. The phenotypic features of giant miscanthus polyploid lines were studied according to standard methods. Best performing polyploidy lines appeared to be line 108 and line 202. They showed best results in such parameters as mass of the aboveground part of plants, plant height, number of rhizomes, number of leaves on the stem, dry matter content and higher ethanol yield owing to increased biomass.

У роботі визначено та охарактеризовано гени цитоскелетних білків (α-, β-, γ-тубулінів і актину) та целюлозосинтаз у геномі льону. На основі структурного аналізу та філогенетичної подібності різні гени даних сімейств білків були віднесені до відповідних функціональних ізотипів. Показано, що поліморфізм довжини інтронів генів тубуліну Linum свідчить про те, що пов'язані з інтронами регуляторні елементи можуть впливати на експресію цих генів, а варіації довжини інтрону 3 α-тубуліну, інтронів 1 і 2 β-тубулінів та інтрону 2 актину позиціонують їх як важливі мішені для дослідження поліморфізму довжини інтронів різних видів Linum (метод ILP). Під час виконання цієї частини роботи було вдосконалено методики комп'ютерних високопродуктивних біоінформатичних досліджень на обчислювальних кластерах та у Ґрід, що сприяло значному покращенню продуктивності таких обчислень, як аналіз послідовностей та моделювання білкових молекул і їх комплесів. Також, було створено унікальну систему менеджменту структурно-біологічних даних, яка дозволила автоматизувати обробку, забезпечити накопичення, анотацію і повторне використання даних, отриманих у ході виконання досліджень. Надалі, було виміряно рівні експресії генів окремих генів CesA, α-тубуліну та актину у проростках та у стеблі на стадії швидкого росту у чотирьох сортів льону різних підвидів і зроблено висновки про функціональну роль різних ізотипів, кодованих цими генами білків. На основі отриманих результатів запропоновано стратегічні підходи для застосування методів редагування генів цитоскелетних білків, перш за все різних генів тубуліну, з метою посилення їх функціональної ролі для покращення целюлозних волокон льону.^UIn this work, the genes of cytoskeletal proteins (α-, β-, γ-tubulin and actin) and cellulose synthases in the flax genome were identified and characterized. Based on structural analysis and phylogenetic similarity, different genes of these protein families were assigned to the corresponding functional isotypes. It is shown that the polymorphism of the intron length of Linum tubulin genes indicates that intron-related regulatory elements can affect the expression of these genes, and variations in the length of intron 3 of α-tubulin, introns 1 and 2 of β-tubulin and intron 2 of actin position them as important targets for the study of intron length polymorphism of different Linum species (ILP method). While working on this part of the work, the methods of computer high-performance bioinformatics research on computational clusters and in Grid were improved, which significantly enhanced the performance of such calculations as sequence analysis and modeling of protein molecules and their complexes. A unique system of structural and biological data management was also created, which allowed to automate the processing, ensure the accumulation, annotation and reuse of data obtained during the research. Furthermore, the expression levels of individual CesA, α-tubulin and actin genes in seedlings and stems at the stage of rapid growth in four varieties of flax of different subspecies were measured and conclusions were made about the functional role of different protein isotypes encoded by these genes. Based on the obtained results, strategic approaches for the application of methods for editing genes of cytoskeletal proteins, primarily various tubulin genes, are proposed in order to strengthen their functional role for the improvement of flax cellulose fibers.

Був проведений пошук Ca2+- (CDPK) і Ca2+-кальмодулін-залежних (CRK) протеїнкіназ рослин, здатних безпосередньо фосфорилювати тубулін, регулюючи таким чином його структурно-функціональні властивості. Найближчими гомологами для протеїнкіназ CaMK2 визначені CPK7, CPK14, CPK32 та CPK21; протеїнкіназ RSK - CPK17, CPK34, CRK2; протеїнкіназ DAPK - CPK20, CPK27; протеїнкіназ CHK2 - CPK16, CPK18, CPK28, CRK4 та CRK6. В ході профільного аналізу були визначені клади різного порядку, що поєднують схожі сайти фосфорилювання білків та асоційовані з ними протеїнкінази ссавців. На основі створених профілів сайтів фосфорилювання були знайдені консенсусні послідовності у складі різних ізотипів тубулінів A. thaliana та визначені протеїнкінази, здатні фосфорилювати рослинні тубуліни - CaMK1A, CaMK2A, CaMKK2 з H. sapiens та CaMK2A з R. norvegicus. Визначені їх найближчі гомологи серез протеїнкіназ A. thaliana: CPK20, CPK21 та GRIK2. В ході роботи була доведена наявність у складі молекул різних субодиниць тубуліну A. thaliana сайтів, що відповідають паттернам фосфорилювання CaMK2. Були побудовані просторові моделі α-/β-тубулінового димеру та малого γ-тубулінового кільця (γTuSC), за допомогою яких була перервірена просторова доступність визначених залишків. Була встановлена наявність потенційного сайту зв'язування інгібіторів KN-93 і KN-62 у структурі Ca2+-зв'язуючого домену CPK1 з A. thaliana, аналогічного до такого у структурі кальмодуліну 1 з H. sapiens, доведена подібність амінокислотного оточення цих сайтів для потенційного лігвнду. Шляхом молекулірного докінгу показана наявність енергетично вигідних сайтів зв'язування KN-93 та KN-62 у структурах кальмодуліну людини та кальцій-залежної протеїнкінази 1 арабідопсису, що дозволяє запропонувати їх використання у якості інгібіторів рослинних протеїнкіназ підродини CDPK.^UThe initial search was performed based on the homology of A. thaliana calcium-dependent protein (CDPK) and calmodulin-dependent kinases (CRK, CDPK-related kinases) and animal protein kinases involved in the regulation of the cytoskeleton according to the literature data. The search was performed by N-J (Neighbor-Joining) clustering of catalytic domain sequences as the most evolutionarily conservative structures. The closest homologues for the CaMK2 protein kinase - CPK7, CPK14, CPK32 and CPK21; for protein kinases RSK - CPK17, CPK34, CRK2; for protein kinases DAPK - CPK20, CPK27; for protein kinase CHK2 - CPK16, CPK18, CPK28, CRK4 and CRK6. Based on the created profiles of phosphorylation sites, consensus sequences were found in the sequences of various isotypes of A. thaliana tubulins, which made it possible to determine protein kinases capable of phosphorylating plant tubulin - CaMK1A, CaMK2A, CaMKK2 from H. sapiens and CaMK2A from R. norvegicus. Their closest homologues among A. thaliana protein kinases were determined: CPK20, CPK21, and GRIK2. The possibility of using calmodulin-targeted CaMK2 protein kinase inhibitors to suppress the activity of plant Ca2+-dependent protein kinases was analyzed. The presence of a potential binding site for inhibitors KN-93 and KN-62 in the structure of the Ca2+-binding domain of CPK1 from A. thaliana, similar to that in the structure of calmodulin 1 from H. sapiens, was determined, and the similarity of the amino acid environment of these sites for potential ligands was proved. Molecular docking has shown the presence of energetically favorable binding sites for KN-93 and KN-62 in the structures of human calmodulin and calcium-dependent protein kinase 1 of arabidopsis, which makes it possible to propose KN-93 and KN-62 as inhibitors of plant protein kinases of the CDPK subfamily.