Скачати повний текст

Дисертаційна робота присвячена аналізу молекулярної організації,еволюції та використання 5S рДНК та генів СО1-СО2 в якості маркернихділянок в оцінці генетичного різноманіття представників різних груп комах(Insecta). У Вступі обґрунтовано вибір теми та її актуальність, зформулюваннімета та завдання дослідження, наведені дані про оприлюднення результатів унаукових працях та апробацію дисертації на наукових форумах.Охарактеризовані наукова новизна та практична цінність отриманихрезультатів. Завершується вступ інформацією про структуру та обсягдисертації. Перший розділ являє собою стислий огляд літератури, у якійвисвітлюються існуючі проблеми та невирішені питання в систематиці комах.Також, у розділі охарактеризовано широко розповсюджені маркерніпослідовності, які застосовуються в сучасних молекулярно-генетичнихдослідженнях для оцінки біорізноманіття (ДНК-баркодингу) не лише комах, ай загалом еукаріот. Одним із найінформативніших ДНК-маркерів для комах насьогоднішній день вважаються поліморфні локуси мітохондріальної ДНК,однак використання лише ділянок мітогеному має свої певні обмеження танедоліки. Зважаючи на це крім послідовностей мтДНК необхідно залучати ймаркерні гени ядерного геному, до яких належать гени рибосомних РНК, асаме 5S рДНК. Проте, для комах потенціал використання 5S рДНК в якостімолекулярного маркеру все ще залишається недостатньо вивченим. З оглядуна це, метою дисертаційного дослідження було проаналізувати мінливістьмітохондріальних генів СО1-СО2 та ядерної 5S рДНК у різних групах комахта оцінити можливості використання цих ділянок геному в якостімолекулярних маркерів для баркодингу та реконструкції філогенетичнихвідносин у досліджуваних таксонах. Для досягнення мети було поставлено наступні завдання:1. Ампліфікувати, клонувати та сиквенувати послідовності генівСО1-СО2 та 5S рДНК представників різних таксономічних груп комах.2. Проаналізувати банк нуклеотидних послідовностей (GenBank) нанаявність просиквенованих ділянок СО1-СО2 та 5S рДНК досліджуваних таблизькоспоріднених видів.3. Дослідити молекулярну організацію обраних для аналізу ділянокгеному та оцінити їх поліморфізм4. За допомогою отриманих даних зробити висновок про можливістьвикористання ділянок CO1-СО2 та 5S рДНК в оцінці генетичного різноманіттякомах.Об’єкт дослідження – генетичний поліморфізм та еволюція геномівеукаріот. Предмет – 5S рибосомна ДНК та гени цитохром оксидази СО1 та СО2.Методи дослідження: у процесі підготовки дисертації було використаносучасні лабораторні методи дослідження, які згадані у другому розділі,зокрема: виділення геномної та плазмідної ДНК, квантифікація ДНК,полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), електрофоретичний аналіз, створеннярекомбінантних конструктів та клонування фрагментів ДНК, сиквенуванняДНК. Також були використані біоінформатичні методи: аналіз сиквенованихпослідовностей ДНК, скринінг геномних баз даних, аналіз повногеномнихархівів, вирівнювання послідовностей ДНК та побудова філогенетичнихдендрограм. Наукову новизну дисертаційного дослідження на основі отриманихрезультатів (третій розділ) розкривають наступні положення:1. Вперше клоновано та сиквеновано гени СО1-СО2 та повторюваніділянки 5S рДНК для різних підвидів медоносної бджоли Apis mellifera,метеликів-шкідників родини Drepanidae та плодових мушок родиниTephritidae.2. Вперше описано хромосомну локалізацію кластерів 5S рДНК умедоносних бджіл, метеликів та плодових мушок, виявлено новий типдиспергованої організації 5S рДНК у геномах метеликів.3. Детально описано та проаналізовано молекулярну організацію,поліморфізм та характер мінливості 5S рДНК у досліджуваних видів.4. Встановлено суттєві відмінності в молекулярній організації ташвидкості еволюції 5S рДНК у різних групах комах.5. Проведено порівняльну оцінку можливостей застосування різнихмолекулярних маркерів, 5S рДНК та гени СО1-СО2 для баркодингу тареконструкції філогенезу комах.Дисертаційну роботу викладено на 158 сторінках машинописноготексту. Робота містить 11 таблиць, 26 рисунків та додаток. Бібліографічний списокскладається з 188 літературних джерел.^UThe dissertation is focused on the analysis of the molecular organization,evolution and use of 5S rDNA and CO1-CO2 genes as marker loci in the evaluationof the genetic diversity of representatives of different groups of insects (Insecta).The Introduction justifies the choice of topic and its relevance, formulates theaim and tasks of the research, provides information on the publication of results inscientific papers and on the approval of the dissertation at scientific forums. Thescientific novelty and practical value of the obtained results are characterized. Theintroduction ends with information about the structure and scope of the dissertation.The first section is a brief review of the literature highlighting existing problems and unresolved issues in insect taxonomy. The section also describes popular marker sequences used in modern molecular genetic studies to assess biodiversity (DNA barcoding) not only of insects but also of eukaryotes in general. Polymorphic loci of mitochondrial DNA are now considered one of the most informative DNA markers for insects. However, the use of only mitogenome regions has its limitations and disadvantages. Considering this, in addition to mtDNA sequences, it is necessary to use marker genes of the nuclear genome, which include ribosomal RNA genes, namely 5S rDNA. However, for insects, the potential of using 5S rDNA as a molecular marker still remains insufficiently studied. In view of this, the aim of the dissertation research was to analyze the variability of mitochondrial CO1-CO2 genes and nuclear 5S rDNA in different groups of insects and to evaluate the possibilities of using these genomic regions as molecular markers for barcoding and reconstruction of phylogenetic relationships in the taxa studied. To achieve the goal, the following tasks were set: 1. To amplify, clone and sequence the CO1-CO2 genes and 5S rDNA of representatives of different taxonomic groups of insects. 2. To search the nucleotide sequences database (GenBank) for the presence of СО1-СО2 and 5S rDNA sequences of the studied and closely related species. 3. To study the molecular organization of the genomic regions selected foranalysis, and to evaluate their polymorphism. 4. Based on the data obtained, draw a conclusion about the possibility of using CO1-СО2 and 5S rDNA regions in the assessment of the genetic diversity of insects. The object of research is genetic polymorphism and evolution of eukaryotic genomes. The subject is 5S ribosomal DNA and genes of cytochrome oxidase СО1 and СО2. Research methods: in the process of preparing the dissertation, modern laboratory research methods were used, which are mentioned in the second chapter, in particular: isolation of genomic and plasmid DNA, DNA quantification, polymerase chain reaction (PCR), electrophoretic analysis, creation of recombinant constructs and cloning of DNA fragments, DNA sequencing. Bioinformaticsmethods were also used: analysis of DNA sequences, screening of genomic databases, analysis of whole genome archives, alignment of DNA sequences and construction of phylogenetic dendrograms. The following statements reveal the scientific novelty of dissertation research based on the results obtained (third section): 1. For the first time, CO1-CO2 genes and 5S rDNA repeated regions were cloned and sequenced for different subspecies of the honey bee Apis mellifera, pest butterflies of the Drepanidae family, and fruit flies of the Tephritidae family. 2. The chromosomal localization of 5S rDNA clusters in honeybees, butterflies and fruit flies was described for the first time, and a new type of dispersed organization of 5S rDNA in butterfly genomes was discovered. 3. The molecular organization, polymorphism, and nature of variability of 5S rDNA in the studied species are described and analyzed in detail. 4. Significant differences in the molecular organization and rate of evolution of 5S rDNA in different groups of insects were revealed. 5. A comparative assessment of the possibilities of using various molecular markers, i.e., 5S rDNA and CO1-CO2 genes for barcoding and insect phylogeny reconstruction was carried out. The thesis is presented on 158 pages of typewritten text. The work contains 11 tables and 26 figures. The references consist of 188 literature sources.

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення актуальної проблеми педіатрії – підвищити ефективність ранньої діагностики, профілактики та лікування IgE-залежної алергії до білків коров'ячого молока шляхом розробки і впровадження нового комплексу лікувально-профілактичних заходів на підставі вивчення її епідеміологічних, біохімічних, імунологічних, молекулярних, генетичних особливостей і формування специфічної оральної толерантності.^UThe dissertation presents a theoretical generalization and a new solution to the topical issue in paediatrics – to increase the effectiveness of early diagnosis, prevention, and treatment of IgE-dependent cow's milk protein allergy (CMPA) by developing and implementing a new set of therapeutic and preventive measures based on its epidemiological, biochemical, immunological, molecular, genetic features and the specific oral tolerance induction.

  Скачати повний текст

Дисертація присвячена конструюванню дріжджових штамів – надпродуцентів L- і D-лактат-селективних оксидоредуктаз, очищенню ферментів та розробці на їх основі, у поєднанні із нанорозмірними матеріалами, нових спектрофотометричних та біосенсорних методів визначення вмісту L- та D-лактату, а також біореакторів для ензиматичного отримання чистих енантіомерів молочної кислоти. За допомогою молекулярно-генетичних підходів сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів Ogataea polymorрha: «tr1» (gcr1 catХ CYB2) – надпродуцент L-лактат: ферицитохром с-оксидоредуктази (флавоцитохрому b2, ФЦ b2), що характеризується восьмикратним підвищенням питомої активності відповідного ферменту в безклітинних екстрактах. Сконструйовано також рекомбінантний продуцент D-лактат: ферицитохром с-оксидоредуктази (DLDH) O. polymorрha «tr6» (gcr1 catX CYB2Δ/DLD1), питома активність DLDН якого збільшується у шість разів, порівняно з вихідними штамами, причому завдяки делеції гена CYB2 штам не синтезує ФЦ b2. Оптимізовано умови синтезу цільових ферментів для обох рекомбінантних штамів дріжджів. Уперше розроблено новий метод очищення ФЦ b2 із екстрактів клітин штаму дріжджів O. polymorрha «tr1» афінною хроматографією на амінопропілсилохромі, модифікованому цитохромом с в ролі ліганда та отримано препарати фермента із питомою активністю 10 Од.·мг-1. Опрацьовано схему очищення мембранного фермента DLDН із клітин штаму дріжджів O. polymorрha «tr6» та отримано очищений препарат із питомою активністю 1,1 Од.·мг-1. Для обох ферментних препаратів проведено фізико-хімічну та ензимологічну характеристику. Доведено можливість використання продуцентів L- та D-лактат-специфічних оксидоредуктаз для продукції чистого D-енантіомера із рацемату молочної кислоти та усунення D-лактату в модельних сумішах.Уперше розроблено новий ензиматично-фотометричний метод кількісного аналізу L-лактату за використання рекомбінантного ФЦ b2 та «Берлінської блакиті». Опрацьовано спосіб реутилізації фермента для визначення вмісту L-лактату за використання ФЦ b2, іммобілізованого на магнітних мікрочастинках. Розроблено новий фотометричний метод кількісного аналізу D-лактату на основі використання клітин та субклітинних фракцій O. polymorрha «tr6» та утворення формазану як кінцевого кольорового продукту.Синтезовано носії для іммобілізації ферментів на основі наночастинок золота. Розроблено новий метод формування золотих наночастинок на поверхні робочого планарного електроду in situ. За використання сканувальної електронної мікроскопії, рентгеноспектрального аналізу, атомно-силової мікроскопії та трансмісійної електронної мікроскопії проведено фізико-хімічну і структурну характеристику отриманих наноматеріалів.На основі пермеабілізованих клітин штаму-надпродуцента ФЦ b2 O. polymorрha «tr1» сконструйовано нові мікробні амперометричні біосенсори з покращеними біоаналітичними характеристиками. Розроблено новий ензимний безмедіаторний амперометричний біосенсор «третього покоління» на L-лактат на основі очищеного рекомбінантного ФЦ b2 та наночастинок золота. Розроблено та охарактеризовано нові мікробні біосенсори на D-лактат з використанням клітинних уламків, субклітинних фракцій, збагачених мітохондріями, та клітин рекомбінантного штаму O. polymorрha «tr6». Завдяки делеції гена CYB2, який кодує L-лактат-селективний флавоцитохром b2, мікробні біосенсори характеризуються високою селективністю до D-енантіомера лактату.Розроблені біоаналітичні підходи на основі рекомбінантних клітин, клітинних уламків та очищених ферментів використано для кількісного аналізу L- та D-лактату в реальних зразках рідин людини, харчових продуктів та фармацевтичних препаратів трансфузійного призначення. Завдяки високій чутливості та селективності, а також надійності та простоті у використанні, опрацьовані ензиматичні та мікробні підходи кількісного аналізу лактату можуть знайти практичне використання в клінічній діагностиці, спортивній медицині та харчових технологіях.^UThe thesis is devoted to construction of yeast strains overproducers of L- and D-lactate-selective oxidoreductases, purification of the enzymes, their combination with nanosized materials, and development on the base of obtained bionanomolecules new spectrophotometric and biosensor approaches for analysis of L- and D-lactate, as well as bioreactors for enzymatic conversion of racemic lactic acid to pure enantiomers.Using molecular genetics approaches, recombinant strain of yeast Ogataea polymorpha: "tr1" (gcr1 catX CYB2) – overproducer of L-lactate: ferricitohrome c-oxidoreductase (flavocytochrome b2, FC b2), characterized by an eight-fold increase in the specific activity of the enzyme, has been constructed. A recombinant producer of D-lactate: ferricitohrom c-oxidoreductase (DLDH) – O. polymorpha "tr6" (gcr1 catX CYB2Δ/DLD1), whose specific activity of DLDN is six-fold greater comparing with the parental strains, has been constructed also. Due to deletion of the CYB2 gene, the strain is not synthesizes FC b2. The conditions for the maximal enzymes synthesis for both recombinant yeast strains have been optimized.For the first time, a new method of purifying FC b2 from extracts of yeast strains O. polymorpha "tr1" by affinity chromatography on aminopropylsilocromes modified with cytochrome c in the role of a ligand has been developed, and preparations of the enzyme with a specific activity of 10 U·mg-1 have been obtained. The scheme of purification of the membrane enzyme DLDN from the cells of O. polymorpha "tr6" has been developed and a purified enzyme preparation with a specific activity of 1.1 U·mg-1 has been obtained. For both enzyme preparations, a physico-chemical and enzyme characteristic has been performed.The possibility of using the yeast producers of L- and D-lactate-specific oxidoreductases for production of pure D-enantiomer from racemic lactic acid and remediation of D-lactate from the model samples has been proved.For the first time a new enzymatic-photometric method of quantitative analysis of L-lactate based on recombinant FC b2 and "Prussian blue" has been reported. The method of reusing of enzyme immobilized on ferromagnetic microparticles has been developed. It is shown that enzyme microparticles can be removed from the reaction solution by magnetic field and reused at least six times without loss of quality of L-lactate analysis.A new photometric method of quantitative analysis of D-lactate based on the use of cell and subcellular fractions of O. polymorpha "tr6" and the formation of formazan as a final colored product has been developed.The nanocarriers for immobilization of the enzymes based on gold nanoparticles were synthesized. A new method of gold nanoparticles formation on the surface of the working planar electrode in situ was developed. The physico-chemical and structural characteristics of the nanomaterials were performed by means scanning electron microscopy, X-ray spectral analysis, atomic force microscopy and transmitted electron microscopy.On the basis of permeabilized cells O. polymorpha "tr1" - overproduced FC b2 new microbial amperometric biosensors with improved bioanalytical characteristics have been constructed. The construction of new microbial ampereometric biosensors with improved bioanalytical characteristics based on permeabilized FC b2-overproductive cells of O. polymorpha "tr1" enriched with an enzyme bound gold nanoparticles have been done. For the first time it has been shown that the enrichment of yeast cells of FC b2, due to the overexpression of the corresponding gene and the addition of immobilized enzyme gold nanoparticles into cells, significantly improves the main operational characteristics of the biosensor (sensitivity, detection limit, storage stability, etc.).A new L-lactate-selective enzymatic mediatorless biosensor of the "third generation" based on purified recombinant FC b2 and gold nanoparticles has been developed.New microbial biosensors for D-lactate with the use of cell debris, subcellular fractions enriched with mitochondria, as well, the cells of recombinant strain O. polymorpha «tr6» have been developed and characterized. Due to the deletion of the CYB2 gene encoding L-lactate-selective flavocytochrome b2, microbial biosensors are highly selective to the D- lactate enantiomer.The developed bioanalytical approaches based on recombinant cells, cell debris, subcellular fractions enriched with mitochondria, as well, purified enzyme preparations were used for quantitative analysis of L- and D-lactate in the real samples of human liquids, food products and transfusion pharmaceuticals. Due to its high sensitivity and selectivity, as well as reliability and ease of use, the developed enzymatic and microbial approaches of quantitative analysis of lactate can be using practically in clinical diagnosis, sports medicine and food technology.

Дисертаційна робота присвячена розробці препаративних методик синтезу, встановленню будови, вивченню фізико-хімічних та біологічних властивостей N-циклоалкілкарбоніл-N-арилтіосечовин, N-[2-(циклоалкіл-(феноксо-(фенілтіо-)ацетил-, ароїл-, гетароїл-)гідразин-1-карбонотіоіл]цикло-алкілкарбоксамідів, 2-(циклопропанкарбоніл)карбонотіоіл)-гідразин-1-карбо-(тіо-)-амідів та продуктів їх гетероциклізації. Встановлено особливості взаємодії генерованих insitu циклоалканкарбонілізотіоціанатів з о-фенілендіаміном і показано, що основними продуктами реакції є N-((2-амінофеніл)карбамотіоіл))циклоалканкарбоксаміди та 3,4-біс(3-(циклоалкан-карбоніл)тіоуреїдо)фенілени, які розділені перекристалізацією із метанолу. Проведено детальне дослідження реакції циклоалканкарбонілізотіоціанатів з гідразин гідратом та встановлено, що результатом реакції є N-(2-(циклоалканкарбоніл)гідразін-1-карбонотіоіл)циклоалканкарбоксаміди. Останні є результатом взаємодії вихідних сполук з циклоалканкарбогідразидами, що підтверджує їх біелектрофільність. Вперше синтезовані оригінальні 4-циклоалканкарбоніл-3-(аміно-, фенілоксо-(тіо)метил-1,5-дигідро-4H-1,2,4-триазол-5-тіони тривалим нагріванням відповідних дизаміщених тіосемикарбазидів. Встановлено, що діацилсемикарбазиди за умов реакції циклізації у концентрованих мінеральних кислотах утворюють відомі 5-R-2-аміно-1,3,4-тіадіазоли. Показано, що останні зазнають додаткового гідролітичного відщеплення циклоалканкарбамідного залишку від молекули. Вперше синтезовані N-(4-oксо-3-R-тіазолідин-2-іліден)-циклоалканкарбоксаміди взаємодією дизаміщенихтіосечовин або діацилтіосемикарбазидів з метил(бутил) хлорацетатом у присутності калію ацетату або у ДМФ у присутності триетиламіну. Всі синтезовані речовини очищено методом кристалізації. Будову синтезованих сполук підтверджено сучасними фізико-хімічними методами аналізу, а саме елементним аналізом, ІЧ-спектрофотометрією, 1Н та 13С ЯМР-спектрометрією, а їх індивідуальність – методом хромато-мас-спектрометрії. В ході виконання дисертаційної роботи було синтезовано 100 (85 вперше) сполук, для яких проведено дослідження біологічної активності з використанням підходів віртуального (молекулярний докінг), високоефективного (мікробіологічні дослідження) та традиційного скринінгу. Розроблена стратегія пошуку діуретиків серед N-(R-карбамотіоіл)циклоалкілкарбоксамідів дозволила виявити ефективну «сполуку-лідер», яка за діуретичним ефектом конкурує з референс-препаратом «Гідрохлоротіазид», та згідно результатів молекулярного докінгу має подібний механізм дії. Запропонована стратегію пошуку нових протисудомних агентів на основі структурної модифікації діацилтіосемикарбазидів, яка включала в себе віртуальний мішень-орієнтований скринінг синтезованих сполук до активних центрів GABAA-, GABAT-рецепторів та NVSCs відомих протиепілептичних лікарських засобів, а за результатами біологічного скринінгу на моделі пентилентетразольних судом виявлена сполука, яка перевищує референс-препарат «Депакін». Проведені дослідження на антибактеріальну активність дозволили виявити ряд перспективних сполук, а саме N-(2-R-гідразин-1-карбонотіоіл)циклоалканкарбоксамідів, як високоактивних протимікробних агентів щодо St. aureusта P. aeruginosa (МІК 3.125-25.0 мкг/мл) з ДГФР-інгібуючою дією. На основі молекулярного докінгу та традиційного мікробіологічного скринінгу розроблена стратегія пошуку фунгіцидних засобів та виявлено ряд перспективних сполук, активність яких перевищує активність препаратів-порівняння «Ципроконазол» та «Гімексазол». Встановлено, що дизаміщенітіосечовини та тіосемикарбазиди не є мутагенними і можуть найти застосування як ефективні рістрегулятори з фунгіцидною дією. В ході вивчення біологічної активності та проведеного аналізу взаємозв'язку «структура-активність» серед похідних N-(R-карбамотіоіл)циклоалкілкарбоксамідів виявлені сполуки, які проявили високі показникиантиконвульсивної, сечогінної, протимікробної, протигрибкової, рістстимулюючої та антифолатредуктазної дії. Виявлено 2 потенційні фунгіцидні агенти, які за значеннями мінімальної інгібуючої концентрації, широтою спектра дії щодо фітопатогенних грибів, перевищують препарат «Ципроконазол» та не проявляють мутагенну дію по відношенню до SalmonellaTA 98 та TA 100.^UThe thesisis devoted to the development o fpreparative methods of synthesis, structure determination, study of physicochemical and biological properties of N-cycloalkylcarbonyl-N-arylthioureas, N-[2-(cycloalkyl-(phenoxo-(phenylthio)-)-acetyl-, aroyl-, hetaroyl-)hydrazine-1-carbonothioyl]cycloalkylcarboxamides, 2-(cyclopropanecarbonyl)carbonothioyl)-hydrazine-1-carbo-(thio-)-amides and products of their heterocyclization. Specifics of interaction between generated insitu cycloalkanecarbonylisothiocyanates and o-phenylenediamine were established. It was shown that themainre action products wereN-((2-aminophenyl)¬carbamothioyl))cycloalkanecarboxamides and 3,4-bis(3-(cycloalkanecarbonyl)¬thioureido)phenylenes, which were separated by recrystallization from methanol. A detailed study of the reaction of cycloalkanecarbonylisothiocyanates with hydrazinehydrate was performed. It was found that the reaction resulted information of N-(2-(cycloalkanecarbonyl)hydrazine-1-carbonothioyl)-cycloalkane-carboxamides. The latter are the result of the interaction of the starting compounds with cycloalkanecarbohydrases, what confirms their dielectrophilic nature. For the first time, the original 4-cycloalkanecarbonyl-3-(amino-, phenyloxo-)(thio-)methyl-1,5-dihydro-4H-1,2,4-triazole-5-thiones were synthesized by long-term heating of the corresponding disubstituted thiosemicarbazides. It was found that diacylsemicarbazides form known 5-R-2-amino-1,3,4-thia-diazoles under the conditions of the cyclizationre action in concentrated mineral acids. It is shown that the latter undergoan additional hydrolytic cleavage of the cycloalkaneure aresidue. For the first time N-(4-oxo-3-R-thiazolidin-2-ylidene)-cycloalkanecar-boxamides were synthesized by the interaction of disubstituted thioureasordiacyl-thiosemicarbazides with methyl-(butyl) chloroacetate in the presence of potassiumacetateor in DMF in the presence of the triethylamine. All synthesized substances were purified by crystallization from solvents. The structure of the synthesized compounds was confirmed by modern physicochemical methods of analysis, namely elemental analysis, IR spectrophotometry, 1H and13C NMR spectrometry, and their individuality - bychromato-massspectrometry. During studies 100 compounds (85 for the first time) were synthesized and studied for biological activity by virtual (molecular docking), high through put (microbiological studies) and traditional screening approaches. The developed strategy of diuretics search amongN-(R-carbamo-thioyl)cycloalkanecarboxamides revealed an effective "compound-leader", which competes with there ference drug "Hydrochlorothiazide" in terms of diuretic effect, and according to the results of molecular docking as a similar mechanism of activity. A strategy fo relaboration of novel anticonvulsant agents based on the structural modification of diacylthiosemicarbazides, which included a virtual target-oriented screening of synthesized compounds to the active centers of GABAA-, GABAT-receptors and NVSCs of known antiepileptic drugs on the biological model, and the results of pentylenetetrazolseizures found a compound that exceeds there ference drug "Depakine". Antibacterial activity studies have revealed several promising compounds, nam elyN-(2-R-hydrazine-1-carbonothioyl)cycloalkanecarboxamides, as high lyactive antimicrobial agents against St. aureus and P. aeruginosa (MIC 3.125-25.0 μg/ml) with DHFR-inhibitory activity. Based on molecular docking and traditional microbiological screening, a strategy for the search for fungicides was developed and several promising compounds with activity exceeds the activity of the comparison drugs Cyproconazole and Hymexazole were identified. It was found that disubstituted thioureas and thiosemicarbazides are notmutagenic and canbeusedas effective growth-regulators with fungicidal activity. The compounds that showed high rates of anticonvulsant, diuretic, antimicrobial, antifungal, growth stimulating and antifouling activities were found during the study of biological activity and analysis of the "structure-activity" relationship among the derivatives of N-(R-carbamothioyl)cycloalkylcarboxamides. Two potential fungicidal agents that exceed Cyproconazole interms of minimum inhibitory concentration, broad spectrum of activity and nomutagenic effect against phytopathogenicfungi were identified.

Отримано результати про участь у канцерогенезі злоякісних асроцитарних гліом біля 1 % генів, що експресуються у головному мозку. Визначено, що чотириразовее зниження кількості РНК зразка астроцитарної пухлини є його нормалізацією із зразком РНК головного мозку людини для адекватного нозерн-аналізу експресії досліджуваних генів. Виділено групи для 203 ідентифікованих генів із відомою функцією, які потенційно задіяні у комплексах процесів неопластичної трансформації астроцитів. Доведено, що активація переважно в гліомах інгібованого у нормі гена Sox-2 може визначати у пухлинах експресію генів, які функціонують лише в проліферованих ембріональних нервових клітинах. Встановлено значно виражену експресію інгібованого у нормі гена HC gp-39 тільки у гліобластомі, для діагностики якої він може використовуватись як молекулярний маркер.

  Скачати повний текст

Розглянуто питання ідентифікації особи в судовій медицині на основі ПЛР-аналізу геномної ДНК кісткової тканини. Проведено порівняльний аналіз основних методів виділення ДНК зі кісткової тканини та її ампліфікації. Розроблено методологічні аспекти проведення судово-медичного молекулярно-генетичного дослідження, об'єктом якого є кісткова тканина різного структурного типу та ступеня збереження. Запропоновано модифікації основних етапів виділення геномної ДНК з тканини кісток, узятих від гнильно змінених, ексгумованих, скелетованих, підданих дії високих температур трупів. Розроблено принципи й умови ПЛР-типування виділеної ДНК кісткової тканини. Запропоновано методичні рекомендації з відбору, підготовки й умов зберігання кісткового біоматеріалу. Розроблено практичні рекомендації з проведення судово-медичної молекулярно-генетичної ідентифікаційної експертизи за кістковими залишками. Модифіковані протоколи виділення ДНК з кісткової тканини та її ПЛР-типування впроваджено у практику судово-медичної експертизи різних регіонів України.

  Скачати повний текст

Вперше ідентифіковано нові гени людини: ген калієвого каналу Kv1.7, ген hUNC93, ген кінази MLK4. Ізолювання кДНК генів здійснено за допомогою методів молекулярної біології - полімеразною ланцюговою реакцією, скринінгу кДНКової бібліотеки, ЗТПЛР і RACE. Для кожного гена визначено рівень експресії в різних тканинах, геномну структуру та хромосомну локалізацію. У виведеній амінокислотній послідовності, яка кодується ідентифікованими генами, визначено домени та мотиви. З використанням інформації про функцію продуктів відповідних гомологів або ортологів ідентифікованих генів, домени та мотиви виведених білків, які кодуються ідентифікованими генами, і хромосомну локалізацію ідентифікованих генів передбачено роль продуктів ідентифікованих генів в організмі людини. Вперше визначено оптимальну концентрацію формаміду та гліцерину в реакційній суміші для секвенування GC-багатих матриць.

  Скачати повний текст

Розроблено методи синтезу та досліджено властивості металовмісних кремнеземів з нанесеними наночастинками золота, срібла та металів підгрупи заліза (Co, Ni, Fe). На підставі використання прищеплених до поверхні кремнеземів кремній гідридних груп та їх відновлювальних властивостей розроблено методи одержання кремнеземів з іммобілізованими наночастинками золота та срібла. Показано, що варіюючи концентрацію взятої для відновлення солі металу, час відновлення та тип кремнеземних матриць, можна у певних межах регулювати розмір частинок металу, що утворюється. Встановлено, що кремнеземи з нанесеними наночастинками золота проявляють досить високу активність в реакції окиснення водню молекулярним киснем. Розроблено відтворювальну методику та досліджено формування стабільних колоїдів нанорозмірного срібла, вкритих кремнеземною оболонкою, за рахунок одночасного відновлення металу й утворення кремнезему в результаті гідролізу та конденсації тристоксисилану. З'ясовано, що наявність на поверхні кремнеземів наночастинок металу піролізу вуглеводнів, залежно від умов, ініціює ріст на поверхні вуглецевих наноструктур.

  Скачати повний текст

Уперше здійснено комплексне дослідження стану клітинно-молекулярних імунологічних механізмів, стану цитокінової регуляції та системи загального і місцевого протеолізу за поєднання ерозивно-виразкових уражень гастродуоденальної зони та бронхіальної астми (БА). Обгрунтовано показання та розроблено методику використання у комплексному лікуванні даних хворих індуктора ендогенного інтерферону - циклоферону. Досліджено клінічну ефективність застосування цього препарату під час лікування БА, поєднаної з гастродуоденальною патологією. Вивчено вплив циклоферону на клітинно-молекулярні імунні механізми запалення, цитокінову регуляцію, стан системи протеолізу.

  Скачати повний текст

За результатами обстежень 2196 осіб доведено, що на формування природженої хромосомної патології у потомстві людини вагомий вплив мають: наявність у батьків A10, B40, D41, D51 антигенів HLA I класу, алель QA1*0301 гена DQA1 LA II класу та порушення функції щитовидної залози аутоімунного характеру, особливо у матерів, а фенотипічні прояви моногенного спадкового захворювання муковісцитозу залежать від особливостей розподілу алелей гена DQA1 головного комплексу гістосумісності. З'ясовано важливу роль інтерферонової системи матері у підтримці та розвитку вагітності в нормі, а підвищені показники спонтанного інтерферону у сироватці крові та амніотичній рідині вагітної жінки є одним з критеріїв природжених вад розвитку плода. Рекомендовано у разі формування груп ризику для пренатальної діагностики хромосомної патології враховувати імуногенетичні особливості подружніх пар у комплексі з ендокринним моніторингом та обстеженням інтерферонового статусу, а для вибору коректних схем лікування пацієнтів, хворих на муковісцитоз, обов'язковим є молекулярно-генетичне обстеження гена ТРБМ у комплексі з дослідженнями генів-модифікаторів, зокрема DQA1-гена.

  Скачати повний текст

Мета дослідження – вивчити особливості клінічного перебігу та встановити ефективність алерген-специфічної імунотерапії (АСІТ) алергічного риніту (АР) у пацієнтів із сенсибілізацією до кліщів домашнього пилу (КДП) на основі оцінки функціонального стану імунної системи при IgE-залежній і IgE-незалежній формах алергічного риніту.У дисертаційній роботі проведено визначення молекулярного профілю сенсибілізації до КДП, проведено порівняльний аналіз альтернативних методів оцінки гіперчутливості у осіб із алергією до КДП. Визначено особливості імунної відповіді та підходи до лікування у пацієнтів з різними патогенетичними механізмами розвитку АР – IgE-залежною і IgE-незалежною формами. Науково обґрунтовано та доведено ефективність застосування АСІТ у пацієнтів з IgE- залежною формою АР, доведено точність персоніфікованого підходу до її застосування.В процесі дослідження було проведено верифікацію алергії у 112 пацієнтів за наступними клінічними ознаками: у 85 (75,9%) хворих були скарги на періодичне/постійне чихання, у 77 (68,7%) – на періодичну ринорею, у 84 (75,0%)– закладеність носа, у 74 (66,1%) – свербіж носа/очей, у 54 (48,2%) –ринокон’юнктивіт, у 44 (39,3%) – сухість шкірних покривів, у 29 (26,9%) – еритематозно-сквамозні висипання на шкірі верхніх кінцівок, верхньої частини грудної клітки, шиї тощо зі свербежем, у 25 (22,3%) – рецидивний бронхообструктивний синдром (БОС). У загальному аналізі крові (ЗАК) у 22 (19,6%) осіб виявлена еозинофілія легкого ступеня (від 0,6 до 1,5 Г/л). У мазку- відбитку слизової порожнини носа у 52 (46,4%) осіб виявлена збільшена кількість еозинофілів (від 17% до 75% у полі зору).Найчастіше серед обстежених пацієнтів був діагностований персистивний (цілорічний) АР - 31 (27,7%) особа та інтермітивний (сезонний) АР - 29 (25,8%) осіб.^UThe purpose of the study is to study the features of the clinical course, the functional state of the immune system, and the effectiveness of allergen-specific therapy (ASIT) in patients with IgE-dependent and IgE-independent forms of allergic rhinitis (AR) caused by sensitization to house dust mites (HDM).In the dissertation work, the molecular profile of sensitization to HDM was determined, and a comparative analysis of alternative methods of assessing hypersensitivity in people with an allergy to HDM was carried out. The features of the immune response and approaches to treatment in patients with different pathogenetic mechanisms of AR development – IgE-dependent and IgE-independent forms – have been determined. The effectiveness of the use of ASIT in patients with IgE-dependent form of AR has been scientifically substantiated and proven, and the accuracy of the personalized approach to its use has been proven.During the study, allergy pathology was verified in 112 patients according to the following clinical signs: 85 (75.9%) patients had complaints of periodic/constant sneezing, 77 (68.7%) - periodic rhinorrhea, 84 (75, 0%) – nasal congestion, 74 (66.1%)–?itchy nose/eyes, 54 (48.2%) – rhinoconjunctivitis, 44 (39.3%) – dry skin, 29 ( 26.9%)–?erythematous-squamous rashes on the skin of the upper limbs, upper chest, neck, etc. with itching, 25 (22.3%) – recurrent broncho-obstructive syndrome (BOS). Mild eosinophilia (from 0.6 to 1.5 G/l) was detected in the general blood test (CBC) in 22 (19.6%) persons. An increased number of eosinophils (from 17% to 75% in the field of view) was found in the smear-print of the nasal mucosa in 52 (46.4%) people.Persistent (year-round) AR, 31 (27.7%) people and intermittent (seasonal) AR, 29 (25.8%) people were most often diagnosed among the examined patients.

Спостережено здатність молекулярного комплексу (МК) дріжджова РНК - тилорон до імуномодуляції, яку даний комплекс виявляє за умов in vivo та in vitro. Вивчено основні характеристики імуномодуляторної активності МК за основних імунологічних тестів. Охарактеризовано вплив МК на розвиток гуморальної імунної відповіді та T-залежний антиген - еритроцити барана та T-незалежний антиген - ліпополісахарид (ЛПС) E. coli. Зафіксовано імуносупресивну дію МК на клітинну імунну відповідь у реакції гіперчутливості сповільненого типу (РГСТ). Показано зниження інтенсивності ГСТ під впливом різних доз МК. Установлено, що різні дози МК пригнічують функціональну активність лімфоцитів у реакції бласттрансформації на різні мітогени (ФГА-, КонA- та ЛПС). Досліджено імуностимулювальні й імуносупресивні механізми впливу МЕ на фагоцитарну активність, процент фагоцитозу та число), клітинний метаболізм (НСТ-тест) клітин фагоцитів у системі in vitro у здорових донорів. Виявлено, що МК підвищує функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагальної ланки у здорових осіб. За результатами дослідження впливу МК на функціонування системи неспецифічної резистентності встановлено, що МК за низьких концентрацій пригнічує цитотоксичну активність природних кілерних клітин периферичної крові, а за високих - підсилює удвічі. Установлено, що МК впливає на рівень експресії рецепторів на лімфоцитах (Лф) периферичної крові: на T - Лф (CD3+), B - Лф (CD22+), а також на їх окремих субпопуляціях CD4+ (T-хелперах) і CD8+ (T-цитотоксичних / ефекторних Лф).

  Скачати повний текст

Дисертаційна робота присвячена вивченню імунозалежних та молекулярно-генетичних механізмів розвитку імунопатологічних синдромів у хворих на системні аутоімунні хвороби, дослідженню їх поширеності та тактики ведення таких хворих з оцінкою фармакотерапевтичної та фармакоекономічної доцільності терапії супроводу.У результаті проведених осліджень удосконалена модель формування персистентних форм хламідійної інфекції в експерименті та визначена роль апоптозу при цьому. Проведено експериментальне моделювання персистентної хламідійної інфекції in vitro з метою вивченням реактивації інфекції на моделі in vivo та оцінки ролі апоптозу у формуванні персистентних форм хламідійної інфекції. Встановлено, що штам C. trachomatis проявляв чітку антиапоптозну дію, а виділені із системи пеніциліну аберантні форми C. trachomatis реорганізовувались у типові елементарні та ретикулярні тільця з наступним розвитком маніфестної інфекції, ступінь вираженості якої залежав від патогенного потенціалу мікроорганізму.^UThis disertation is dedicated to the study of the immune - dependent and molecular genetic mechanisms of the development of immunopathological syndromes in patients with systemic autoimmune diseases, and to the study of their prevalence and management of such patients with assessment of pharmacotherapeutic and pharmacoeconomic feasibility of support therapy.It as improved the model of the formation of persistent Chlamydia infection forms in the experiment and determinated the role of apoptosis in this pathology. Also it was performed the experimental modeling of persistent chlamydial infection in vitro for reactivation infection study in vivo models and described the role of apoptosis in the formation of persistent chlamydia infection forms. It was found that the strain C. trachomatis showed a clear anti apoptotic effect, and isolated aberrant forms of C. trachomatis from the penicillin system were reorganized into typical elementary and reticular bodies with the subsequent development of a manifest infection, depended on the pathogen severity.

Дисертаційна робота присвячена з'ясуванню біоекологічних особливостей існування та масштабів впливу на дендрофлору України видів-інвайдерів родини Gracillariidae (Lepidoptera). З'ясовано біологічні особливості видів-інвайдерів цієї родини лускокрилих. Визначено масштаби та спрямованість інвазії п'ятьох видів Gracillariidae на території України. Виявлені особливості заселення різниз екосистем. У роботі показано вплив живлення гусені Gracillariidae на кормові рослини. Гусінь видів-інвайдерів впливає на функціональний стан кормових рослин, що підтверджується змінами у вмісті розчинних білків, активності та ізоферментному складі бензидинової пероксидази протягом їх вегетації. Дослідження динаміки вмісту легкорозчинних білків показало їх зниження за високого рівня ураження гусінню листя. Показником біохімічної адаптації рослин до живлення гусені інвазійних молей-строкаток виявилась перебудова як активності, так й ізозимного профілю пероксидази. Статистично значимі відмінності встановлено для розчинної пероксидази, активність якої підвищувалась у середньому в 2,1 рази за високого ураження гусінню листя кормових рослин. Високий рівень ураження листя фітофагом знайшов своє відображення в зміні ізозимного профілю бензидин-пероксидази. Основною закономірністю за негативного впливу гусені Gracillariidae є суттєве підвищення активності найбільш кислих молекулярних форм цитоплазматичної пероксидази в листі кормових рослин. Отримані результати демонструють активізацію ферментативної антиоксидантної системи захисту рослин на пошкоджуючу дію гусені Gracillariidae, що дозволяє рослині вижити і завершити програму онтогенезу в несприятливих умовах. Найбільш вагомим для захисту клітин від гусені є підвищення активності гваякол-пероксидази, що свідчить про посилення бар'єрних властивостей клітин. Установлено, що гусінь інвазійних Gracillariidae чинить істотний вплив на фотосинтетичний апарат кормових рослин. Цей вплив вдалось чітко визначити методом флуоресценційного аналізу, який був здійснений портативним флуорометром «Флоратест». Живлення гусені C. ohridella спричиняє зниження активності фотосинтетичного апарату A. hippocastanum незалежно від просторового розташування листків у кроні дерева. У листках A. hippocastanum під впливом живлення C. ohridella кількість хлорофілу, що не бере участі у фотосинтетичному переносі енергії на реакційні центри, зростає. І навпаки, протягом розвитку лише однієї генерації C. ohridella спостерігається постійне зниження квантової ефективності ФС ІІ (пригнічення фотосинтетичної активності). Вже на початку розвитку міни (перший вік гусені C. ohridella) на листках освітленої і затіненої частини крони спостерігалось істотне зниження активності та підвищення коефіцієнта плато, що своєю чергою свідчить про інгібування фотофізичних і фотохімічних процесів фотосинтезу та скорочення пулу акцепторів електронів у електрон-транспортному ланцюзі. Такі патологічні зміни зумовлено зниженням вмісту активного хлорофілу (складової пігмент-білкових комплексів ФС ІІ) та його деструкцією. Величини ключових параметрів індукції флуоресценції хлорофілу свідчать про істотне інгібування процесів фотосинтезу та порушення злагодженості реакцій циклу Кальвіна. Наслідком пошкодження фотосинтетичного апарату рослин є зниження вмісту пігментів фотосинтезу, оскільки ці метаболічні перетворення визначаються локальними змінами в структурі і функціях хлоропластів. У результаті наших досліджень не було виявлено залежності між параметрами урбоценозів в яких відбувався розвиток мін інвайдерів та кількістю уражених паразитоїдами личинок. Встановлено лише залежність між кількістю мін інвайдера та ступенем їх ураження паразитоїдами (Hymenoptera). З'ясована відносна стійкість інвазійних Gracillariidae у новому для них середовищі до захворювань. Факт ураження преімагінальних стадій розвитку ентомопатогеном було встановлено лише для Macrosaccus robiniella. Уперше для території України встановлено факт зараження гусені інвайдерів грибом Lecanicillium sp. (Verticillium).^UThe dissertation work is devoted to elucidating the bioecological characteristics of the existence and the influence degree of invasive leaf-mining insect species from Gracillariidae family (Lepidoptera) on dendroflora in Ukraine. Results were obtained for the first time that demonstrate the taxonomic, faunal and zoogeographic structure of the species complex in family of leaf-mining insects (Gracillariidae) in Ukraine. Biological characteristics of invasive insect species within this family of Lepidoptera were clarified. The invasion degree in five Gracillariidae species on the territory of Ukraine has been determined. The scientific work found the effect of Gracillariidae feeding on the forage plants. Caterpillars of invasive species affect the functional state of forage plants, which was confirmed by changes in soluble protein content, activity and isoenzyme composition of benzidine peroxidase during the growing season of these plants. The study of easily soluble protein dynamics showed their decrease when a high-degree leaf damage. An indicator of biochemical adaptation of plants to the diet of caterpillars of invasive leaf miners involves the restructuring of both the activity and the isozyme profile of peroxidase. Statistically significant differences were found for soluble peroxidase which activity increased by average of 2.1 times due to the high-level damage of leaves in forage plant by the caterpillars. High level of leaf damage by the phytophage was reflected in the change in the isozymic profile of benzidine peroxidase. The main pattern of negative effects of Gracillariidae caterpillars involves a significant increase in the activity of the most acidic molecular forms of cytoplasmic peroxidase in the leaves of forage plants. The results obtained demonstrate an activation of enzymatic antioxidant protection system in forage plants due to the damaging effect of Gracillariidae invasive caterpillars, which allows a plant organism to survive and complete the ontogenesis program in adverse conditions. The most significant factor in protecting cells from caterpillar activity involves an increase in the activity of guaiacol peroxidase, which indicates an increase in the cell barrier properties. It was established that the caterpillars of Gracillariidae invasive species effect significantly on the photosynthetic apparatus of forage plants. This effect was clearly determined with the fluorescence technique which was carried out using a portable fluorometer "Floratest". Analysis of the Kautsky curves in damaged and non-damaged leaves allow to state that the feeding of miners from the Gracillariidae family significantly affects the four main parameters of chlorophyll fluorescence intensity (CFI). The studies have shown that CFI technique allows to determine the general condition of plant organism in an express regime by evaluating photosynthesis as the main process in plant life. A range of parasitoids and fungal diseases of preimaginal stages of invasive development has been identified for the first time in Ukraine.

  Скачати повний текст