Скачати повний текст

  Скачати повний текст

З фагової бібліотеки генів S. slobisporus 1912 відібрано три рекомбінантні фаги, які містять кластер генів біосинтезу протипухлинного антибіотика "Ландоміцину E" (LaE; lnd-кластер). За допомогою секвенування виявлено 28 структурних lnd-генів, що контролюють формування молекули LaE, один ген позитивної регуляції синтезу LaE (lndI) та один ген стійкості до LaE (lndJ). Делеції у межах lnd-кластеру призводять до припинення або змін у біосинтезі LaE, що доводить участь lnd-генів у продукції цього антибіотика. За допомогою цього спрямованого мутагенезу вивчено роль окремих lnd-генів, що забезпечують циклізацію лінійного полікетидного попередника LaE та його модифікацію. Установлено, що ген lndL кодує циклазу-ароматазу 1 та 2 кілець, lndF - циклазу, що каталізує унікальну ангулярну циклізацію 3-го кільця. Ген оксигенази lndM контролює окиснення 3-го кільця попередника LaE, а ген lndGT4 - останній етап біосинтезу LaE - приєднання дезоксицукру L-родинози до дисахаридного попередника. Гени lndZ4 та lndZ5 відповідають за гідроксилювання першого кільця попередника LaE у позиції C11. Шляхом спрямованого мутагенезу lndGT4 одержано 3 нові ландоміцини F, G, H, з різною кількістю цукрів у своїх молекулах і без гідроксильної групи у позиції C11 аглікону. У гетерологічних господарях експресія lnd-генів з власних промоторів залежить від експресії регуляторного гену lndI. Визначено, що експресія генів lndMlndNlndOlndPlndGlndHlndQlndRlndSlndT під контролем конститутивного промотора гену апраміцинстійкості aac(3)IV у продуценті спорідненого антибіотика "Урдаміцину A" призводить до продукції нового ангуцикліна.

  Скачати повний текст

Визначено механізм утворення гексасахаридного "хвоста" та показано послідовність реакцій глікозидного перенесення. Уперше для антибіотичних глікозилтрансфераз показано, що у процесі біосинтезу ландоміцину A LanGT1 і LanGT4 працюють двічі за різних акцепторних субстратів. Показано функцію гену lanZ2 Lan-кластеру та вплив його інактивації на спектр продуктів біосинтезу штаму S. cyanogenus S136. За результатами мас-спектральних аналізів з'ясовано, що LanZ2 сприяє утворенню ландоміцинів з довшою частиною. Уперше показано можливість проведення гетерологічної експресії глікозилтрансферази UrdGT2 у мутантних штамах S. cyanogenus S136, внаслідок чого змінюється місцеположення та характер глікозилювання ангуциклінів. Якщо у нативній молекулі перший цукровий залишок приєднано через C - O глікозидний зв'язок, то у рекомбінантному ангуцикліні відбувається зміна на C - C глікозидний зв'язок, який є більш стабільний. Одержано похідні деяких біологічно активних атрахіонів шляхом біотрансформації у штамі Saccharatrix espaniensis.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

Виділено та досліджено колагенази та кератинази стрептоміцетів. Проведено скринінг серед 364 штамів - представників різних таксономічних груп (мікроміцетів, дріжджів, бацил та стрептоміцетів) на здатність синтезувати колагеназу та кератиназу, за результатами чого відібрано два ефективні продуценти ферментів Steptomyces sp. 1349 і Steptomyces sp. 1382. Дослідження гетерогенності популяцій штамів-продуцентів дало можливість відібрати серед колоній дикого типу продуцента колагенази морфологічний варіант, активність якого була в 2,3 рази вищою за вихідну та зберігалася протягом двох років. Установлено, що хлорид амонію та соєве борошно здатні активувати біосинтез колагенази культурою Steptomyces sp. 1349 в 5 - 6 разів, а овеча шерсть або куряче пір'я як єдине джерело вуглецю та азоту в середовищі підвищують вихід кератинази у Steptomyces sp. 1382 майже у сім разів. Із культуральних рідин продуцентів виділено та очищено до гомогенного стану високоактивні препарати колагенази та кератинази. Показано, що колагенолітичну дію мають принаймні три протеази, дві з яких є металопротеазами, а одна відноситься до протеаз серинового типу. Виявлено, що за кератиназну активність Steptomyces sp. 1382 відповідають дві протеази серинового типу. Досліджено фізико-хімічні властивості очищених ферментів, специфічність їх дії. Установлено, що препарати відрізняються за молекулярними масами, компонентним складом, оптимальними умовами дії, чутливістю до катіонів металів і аніонів. Показано, що колагенази проявляють широку специфічність дії щодо білкових субстратів різної природи.нативний кератин шерсті або пір'я, а також один з ферментів проявляє фібринолітичну активність. Установлено, що колагенази Steptomyces sp. 1349 не мають серологічної спорідненості з ферменом, виділеним з Clostridium histolyticum ("Merk"). Показано інгібуючу дію деяких координаційних сполук германію, похідних гаунідину та інгібіторів вірусного протеолізу на колагеназну та кератиназну активність Steptomyces sp. 1349 і Steptomyces sp.1382, що може бути використано у разі створення високоефективних препаратів для лікування захворювань шкіри, які спричинюються колагеназами та кератиназами мікроорганізмів, а також в інших галузях народного господарства.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

Створено ефективну методику перенесення плазмідних ДНК в штами S. globisporus 1912 і S. kanamyceticus 1. Показано ефективність використання цієї методики для цілого ряду штамів актиноміцетів - продуцентів антибіотиків, для яких до цього часу інших шляхів перенесення рекобінантних ДНК описано не було. Охарактеризовано вплив реплікативних та інтегративних плазмід на біосинтез ландоміцинів та канаміцинів, стабільність їх успадкування в досліджуваних штамах. За допомогою ДНК - ДНК гібридизації досліджено характер інтеграції плазміди pSET152 в хромосоми штамівS. globisporus 1912, S. kanamyceticus 1, S. fradiae Tu2717 і S cyanogenus S136. Уперше клоновано та секвентовано ділянки хромосоми штаму S. kanamyceticus 1, в які проходить інтеграція плазміди pSET152. Сконструйовано кон'югативну плазміду із здатністю інтегрування з використанням інтегративної системи фага VWB, перспективність застосування якої показано для одержання стабільних рекомбінантних штамівS. globisporus 1912 та S. kanamyceticus 1. У результаті спрямованого руйнування гена доведено, що lnd-гени конролюють біосинтез ландоміцину E, показано перспективність використання цього методу для вивчення інших генів біосинтезу. Показано перспективність використання lnd-генів для їх гетерологічної експресії в штамі S. fradiae Tu2717. У процесі вивчення ефективності проходження гомологічної рекомбінації в штамі S. cyanogenus S136 одержано ряд нових ландоміцинів у ньому. На підставі масспектрального аналізу виявлено, що в цих сполук змінений аглікон та глікозидна частина.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст