Скачати повний текст

  Скачати повний текст

З фагової бібліотеки генів S. slobisporus 1912 відібрано три рекомбінантні фаги, які містять кластер генів біосинтезу протипухлинного антибіотика "Ландоміцину E" (LaE; lnd-кластер). За допомогою секвенування виявлено 28 структурних lnd-генів, що контролюють формування молекули LaE, один ген позитивної регуляції синтезу LaE (lndI) та один ген стійкості до LaE (lndJ). Делеції у межах lnd-кластеру призводять до припинення або змін у біосинтезі LaE, що доводить участь lnd-генів у продукції цього антибіотика. За допомогою цього спрямованого мутагенезу вивчено роль окремих lnd-генів, що забезпечують циклізацію лінійного полікетидного попередника LaE та його модифікацію. Установлено, що ген lndL кодує циклазу-ароматазу 1 та 2 кілець, lndF - циклазу, що каталізує унікальну ангулярну циклізацію 3-го кільця. Ген оксигенази lndM контролює окиснення 3-го кільця попередника LaE, а ген lndGT4 - останній етап біосинтезу LaE - приєднання дезоксицукру L-родинози до дисахаридного попередника. Гени lndZ4 та lndZ5 відповідають за гідроксилювання першого кільця попередника LaE у позиції C11. Шляхом спрямованого мутагенезу lndGT4 одержано 3 нові ландоміцини F, G, H, з різною кількістю цукрів у своїх молекулах і без гідроксильної групи у позиції C11 аглікону. У гетерологічних господарях експресія lnd-генів з власних промоторів залежить від експресії регуляторного гену lndI. Визначено, що експресія генів lndMlndNlndOlndPlndGlndHlndQlndRlndSlndT під контролем конститутивного промотора гену апраміцинстійкості aac(3)IV у продуценті спорідненого антибіотика "Урдаміцину A" призводить до продукції нового ангуцикліна.

  Скачати повний текст

Вивчено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp. caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. Установлено, що у досліджених штамів відбуваються спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності до антибіотиків. Показано, що мутанти Sacch. erythraea стійкі до рифампіцину, хлорамфеніколу, гіострептону та стрептоміцину, мутанти S. peucetius subsp. caesius стійкі до даунорубіцину та доксорубіцину, а також мутанти S. kanamyceticus стійкі до аміноглікозидів та є перспективними для селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. З бібліотеки генома продуцента ландоміцину E S. globisporus 1912 клоновано та секвеновано кластер генів біосинтезу цього антибіотика. У ньому вивлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28-ми з них. Ідентифіковано п'ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину в S. kanamyceticus. Клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує метилазу 16S pРНК та зумовлює стійкість S. kanamyceticus до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Опрацьовано схеми клонування генів у штамах S. kanamycenticus та S. globisporus за допомогою кон'югаційного перенесення плазмід з E. coli.доксорубіцин та продукції нових ландоміцинів H, F та G.

  Скачати повний текст

Визначено механізм утворення гексасахаридного "хвоста" та показано послідовність реакцій глікозидного перенесення. Уперше для антибіотичних глікозилтрансфераз показано, що у процесі біосинтезу ландоміцину A LanGT1 і LanGT4 працюють двічі за різних акцепторних субстратів. Показано функцію гену lanZ2 Lan-кластеру та вплив його інактивації на спектр продуктів біосинтезу штаму S. cyanogenus S136. За результатами мас-спектральних аналізів з'ясовано, що LanZ2 сприяє утворенню ландоміцинів з довшою частиною. Уперше показано можливість проведення гетерологічної експресії глікозилтрансферази UrdGT2 у мутантних штамах S. cyanogenus S136, внаслідок чого змінюється місцеположення та характер глікозилювання ангуциклінів. Якщо у нативній молекулі перший цукровий залишок приєднано через C - O глікозидний зв'язок, то у рекомбінантному ангуцикліні відбувається зміна на C - C глікозидний зв'язок, який є більш стабільний. Одержано похідні деяких біологічно активних атрахіонів шляхом біотрансформації у штамі Saccharatrix espaniensis.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

Виділено та досліджено колагенази та кератинази стрептоміцетів. Проведено скринінг серед 364 штамів - представників різних таксономічних груп (мікроміцетів, дріжджів, бацил та стрептоміцетів) на здатність синтезувати колагеназу та кератиназу, за результатами чого відібрано два ефективні продуценти ферментів Steptomyces sp. 1349 і Steptomyces sp. 1382. Дослідження гетерогенності популяцій штамів-продуцентів дало можливість відібрати серед колоній дикого типу продуцента колагенази морфологічний варіант, активність якого була в 2,3 рази вищою за вихідну та зберігалася протягом двох років. Установлено, що хлорид амонію та соєве борошно здатні активувати біосинтез колагенази культурою Steptomyces sp. 1349 в 5 - 6 разів, а овеча шерсть або куряче пір'я як єдине джерело вуглецю та азоту в середовищі підвищують вихід кератинази у Steptomyces sp. 1382 майже у сім разів. Із культуральних рідин продуцентів виділено та очищено до гомогенного стану високоактивні препарати колагенази та кератинази. Показано, що колагенолітичну дію мають принаймні три протеази, дві з яких є металопротеазами, а одна відноситься до протеаз серинового типу. Виявлено, що за кератиназну активність Steptomyces sp. 1382 відповідають дві протеази серинового типу. Досліджено фізико-хімічні властивості очищених ферментів, специфічність їх дії. Установлено, що препарати відрізняються за молекулярними масами, компонентним складом, оптимальними умовами дії, чутливістю до катіонів металів і аніонів. Показано, що колагенази проявляють широку специфічність дії щодо білкових субстратів різної природи.нативний кератин шерсті або пір'я, а також один з ферментів проявляє фібринолітичну активність. Установлено, що колагенази Steptomyces sp. 1349 не мають серологічної спорідненості з ферменом, виділеним з Clostridium histolyticum ("Merk"). Показано інгібуючу дію деяких координаційних сполук германію, похідних гаунідину та інгібіторів вірусного протеолізу на колагеназну та кератиназну активність Steptomyces sp. 1349 і Steptomyces sp.1382, що може бути використано у разі створення високоефективних препаратів для лікування захворювань шкіри, які спричинюються колагеназами та кератиназами мікроорганізмів, а також в інших галузях народного господарства.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

Створено ефективну методику перенесення плазмідних ДНК в штами S. globisporus 1912 і S. kanamyceticus 1. Показано ефективність використання цієї методики для цілого ряду штамів актиноміцетів - продуцентів антибіотиків, для яких до цього часу інших шляхів перенесення рекобінантних ДНК описано не було. Охарактеризовано вплив реплікативних та інтегративних плазмід на біосинтез ландоміцинів та канаміцинів, стабільність їх успадкування в досліджуваних штамах. За допомогою ДНК - ДНК гібридизації досліджено характер інтеграції плазміди pSET152 в хромосоми штамівS. globisporus 1912, S. kanamyceticus 1, S. fradiae Tu2717 і S cyanogenus S136. Уперше клоновано та секвентовано ділянки хромосоми штаму S. kanamyceticus 1, в які проходить інтеграція плазміди pSET152. Сконструйовано кон'югативну плазміду із здатністю інтегрування з використанням інтегративної системи фага VWB, перспективність застосування якої показано для одержання стабільних рекомбінантних штамівS. globisporus 1912 та S. kanamyceticus 1. У результаті спрямованого руйнування гена доведено, що lnd-гени конролюють біосинтез ландоміцину E, показано перспективність використання цього методу для вивчення інших генів біосинтезу. Показано перспективність використання lnd-генів для їх гетерологічної експресії в штамі S. fradiae Tu2717. У процесі вивчення ефективності проходження гомологічної рекомбінації в штамі S. cyanogenus S136 одержано ряд нових ландоміцинів у ньому. На підставі масспектрального аналізу виявлено, що в цих сполук змінений аглікон та глікозидна частина.

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст

  Скачати повний текст