Дисертація присвячена виявленню нової ролі білків родини інтерсектинів (ITSN1 та ITSN2) як адаптерних білків під час N-WASP-залежної полімеризації актину. Було ідентифіковано два нових партнера інтерсектинів – WIP та CR16, які через взаємодію з факторами нуклеації, такими як N-WASP та кортактин, регулюють полімеризацію актину. У роботі найбільш охарактеризовано взаємодію інтерсектинів з одним із ключових компонентів подосом та інвадоподій – WIP. Вперше продемонстровано, що ендогенні ITSN1 та ITSN2, а також комплекс ITSN1/WIP є компонентами інвадоподій. Показано, що WIP зв'язує SH3A-, SH3C-, SH3E-домени ITSN1 та ITSN2. Доведено пряму взаємодію між ITSN1 та WIP через амінокислотні залишки 318-450 пролін-збагаченого домену WIP. Виявлено, що комплекс ITSN1/WIP є компонентом RAB4-позитивних везикул, бере участь у везикулярному транспорті рецептора трансферину та індукує утворення філоподієподібних виступів. Встановлено існування потрійного комплексу між ITSN1, WIP та N-WASP, у складі якого WIP сприяє взаємодії між N-WASP та інтерсектином.Вперше продемонстровано наявність білок-білкового комплексу між інтерсектинами та CR16, який залучено до передачі сигналу в нейронах та сперматогенезу. Встановлено, що CR16 взаємодіє з нейрон-специфічною ізоформою SH3A-домена ITSN1 та SH3E-доменом ITSN2, причому ITSN1 зв'язує CR16, який знаходиться в комплексі з β-актином і сприяє локалізації інтерсектину з полімеризованим актином.^URearrangements of actin cytoskeleton are important for normal cell functioning and their deregulation leads to various pathologies (e.g. cancer cell invasiveness). The members both ITSN (ITSN1, ITSN2) and verprolin families (WIP, CR16, WIRE) play an important role in actin cytoskeleton remodeling. ITSNs are associated with the progression of several neurodegenerative pathologies and are implicated in cancer cell survival and migration. The members of the mammalian verprolin protein family are well known interactors with actin and nucleation factors such as cortactin and N-WASP, and can influence the Arp2/3-dependent actin polymerization machinery. Thus, SH3-containing ITSNs and proline-rich verprolins could act as partner proteins because of participation in the same processes such as endocytosis and actin cytoskeleton rearrangement and possessing putative interaction motifs.The presented work is devoted to the study of ITSN interaction network in actin remodeling by identifying new partner proteins WIP and CR16. Immunoprecipitation and in vitro binding experiments revealed that ITSNs bind WIP and these interactions are mediated by the SH3A, SH3C and SH3E domains of ITSNs. Our results show that interactions between ITSN1 and WIP are direct. For the mapping of ITSN1-interacting regions of WIP structure, WIP deletion constructions have been used, which led to the identification of the importance of 318-450 aa of WIP proline-rich domain for the above mentioned interactions. In addition, we have demonstrated that ITSN1 forms a complex with WIP and N-WASP. The immunofluorescence analysis revealed partial co-localization of ITSN1 and ITSN2 with WIP in mammalian cells.Recent studies denote that WIP is one of the key components of podosomes and invadopodia. While analyzing proteolytic degradation of extracellular matrix, it has been shown that endogenous ITSN1 and ITSN2 as well as ITSN1/WIP complex are localized in invadopodia of MDA-MB-231 breast cancer cell line. It is known that Cdc42/N-WASP/WIP-dependent actin polymerization via the Arp2/3 complex is required for invadopodia formation. Given the ability of ITSNs to activate Cdc42 and directly interact with N-WASP and WIP, we suggest that ITSNs could be involved in actin polymerization during invadopodia formation.In the immunofluorescence experiments, co-localization between ITSN1, WIP and clathrin has been demonstrated, indicating their possible ability to participate in clathrin-mediated endocytosis. An analysis of transferrin receptor internalization revealed defects of intracellular transferrin transport in 293 cells with overexpressed ITSN1-L or WIP whereas co-expression of ITSN1-L and WIP normalized transferrin internalization suggesting participation of the complex in the regulation of vesicular transport. Intracellular redistribution of transferrin occurs by several ways including RAB4-dependent early endosomes. Partial co-localization of WIP and ITSN1 proteins with a marker of recycling endosomes, RAB4, has been demonstrated. Moreover, overexpressed ITSN1 promoted significant co-distribution of WIP to RAB4-positive vesicles in MCF-7 cells. Together, these findings suggest that WIP/ITSN1-L complex is involved in the cytoplasmic vesicle trafficking, in particular, in the fast recycling of the transferrin receptor.The immunofluorescence analysis revealed that both ITSN1-L and WIP co-localize at the filopodia sites and actively and synergistically induce filopodia formation.For the first time, it has been demonstrated that both members of the ITSN family, ITSN1 and ITSN2, interact with another member of the verprolin family, CR16. In vitro binding experiments showed that the interaction of ITSNs with CR16 is mediated predominantly by neuron-specific isoform of ITSN1 SH3A domain and the SH3E domains of ITSN2. Moreover, overexpressed CR16 promoted the association between ITSN1 and F-actin.Thus, this manuscript presents the data of new molecular components of invadopodia, ITSN1 and ITSN2, and their interactions with one of key invadopodia proteins, WIP. Obtained results of interactions between intersectins and regulators of actin polymerization, CR16 and WIP, can be used for further study of the functioning of N-WASP/Arp2/3-mediated rearrangements of actin cytoskeleton, which defects of regulation are linked to the development of malignant tumors.

Мета дисертаційної роботи - підвищення ефективності лікування дітей з соматотропною недостатністю (СН) на підставі вивчення взаємозв’язку системи ГР/ростові фактори, рівню вітаміну D та поліморфізмів гена рецептора вітаміну D.Для досягнення мети та вирішення завдань дослідження у відділі дитячої ендокринної патології ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України» нами було проведено обстеження 226 дітей з низькорослістю.При проведенні дослідження використовувалися загальноклінічні; гормональні та біохімічні обстеження: визначення тиреотропного гормону (ТТГ), вільного тироксину (вілТ4), інсуліноподібного чинника росту-1 (ІПЧР-1), фонового та стимульованого рівнів ГР, вмісту віт D, греліну (Ghr), паратгормону (ПТГ), вітамін D-зв’язуючого глобуліну (ВD-ЗГ); молекулярно-генетичні методи; інструментальні та статистичні методи дослідження.У пацієнтів з СН виявлена позитивна кореляція між вмістом 25(ОН)D та рівнем ІПЧР-1, встановлений зворотній зв’язок віт D з КВ, а також прямі кореляційні відношення між рівнем ІПЧР-1, стимульованим рівнем ГР, рівнем паратгормону та КВ. Рівень Ghr має зворотню кореляцію з ВD-ЗГ i прямо корелює з фоновим і стимульованим рівнями ГР та рівнем ІПЧР-1. З’ясовано, що найчастіше у більшості пацієнтів із СН при поліморфізмі BsmI гена рецептора віт D (VDR) та при поліморфізмі гена COLIA1 зустрічається алель G. При поліморфізмі BsmI гена VDR носіями генотипу GA були 53,57% обстежених, а генотипу GG - 25%; при поліморфізмі гена COLIA1- носіями генотипу GG були 53,57%, генотипу GT - 39,29% осіб. При поліморфізмі ApaI гена VDR домінував генотип АС. Встановлено зв’язок середньої сили генотипу ТС TaqI VDR з низьким рівнем 25(OH)D в плазмі крові. Наявність генотипу АС ApaІ VDR у 8,43 раз підвищує шанси наявності гіповітамінозу D. Визначено, що поліморфізми BsmI та АраI гена VDR є значущими клініко-діагностичними факторами для оцінки ризику розвитку СН. Наявність алеля G BsmI та алеля А АраI вірогідно асоціюється з високим ризиком розвитку СН, як при гомо-, так і при гетерозиготних генотипах. Наявність гомозиготного генотипу АА BsmI VDR та гомозиготного генотипу СС АраI VDR можна розглядати як протекторні поліморфізми щодо СН.Встановлено, що додавання препаратів віт D призводить до підвищення ефективності лікування препаратами рГР. Додавання в схему лікування віт D гальмує зниження швидкості росту, яке відбувається після першого року монотерапії рГР, і в подальшому швидкість росту залишається стабільною та прийнятною для досягнення задовільних показників росту.Наукова новизна дослідження полягає в тому, що вперше проведено комплексне дослідження особливостей стану системи ГР/ІПЧР-1 у дітей препубертатного віку із СН в умовах різного забезпечення організму віт D.Вивчені показники ростового фактора греліну у дітей препубертатного віку з СН.Вперше в Україні проведено дослідження генотипових особливостей дітей з СН, а саме вивчення розподілу частот алелів та генотипів BsmI, TaqІ, ApaI гена VDR та поліморфізм гена COLІA1 у пацієнтів із СН.Наявність алеля G BsmI та алеля А АраI вірогідно асоціюється з високим ризиком розвитку СН, як при гомо-, так і при гетерозиготних генотипах. Наявність гомозиготного генотипу АА BsmI VDR та гомозиготного генотипу СС АраІ VDR можна розглядати як протекторні поліморфізми щодо розвитку СН.Вперше в Україні визначена доцільність та ефективність включення препаратів віт D до комплексної терапії препаратами рГР. Включення віт D до комплексної терапії таких пацієнтів призводить до вірогідної прибавки в рості. Практичне значення отриманих результатів полягає в наступному:Встановлено суттєвий дисбаланс віт D у більшості дітей із СН, незалежно від форми захворювання, що передбачає обов’язкове дослідження вмісту віт D до початку та на тлі застосування препаратів рГР у дітей з даною патологією, а також нормалізацію його рівня до початку терапії препаратами рГР.Встановлено, що за наявності зниження ефективності терапії препаратами рГР після перших років лікування рекомендовано застосування комбінованої терапії дітей із СН препаратами рГР та віт D.Встановлено, що носійство алеля G BsmI VDR, та носійство алеля А АраІ VDR вірогідно асоціюється з ризиком розвитку СН, що може бути додатковим діагностичним тестом. Ключові слова: вітамін D, поліморфізм гена рецептора вітаміну D, гормон росту, інсуліноподібний чинник росту-1, грелін, паратгормон, вітамін D-зв’язуючий глобулін, соматотропна недостатність, рекомбінантний людський гормон росту, діти, підлітки, лікування.^UThe goal of study is to increase the treatment efficacy in children with growth hormone deficiency based on the study of the relationship between the GH /growth factors axis, vitamin D level and the vitamin D receptor gene polymorphisms. Clinical evaluation was performed in the Department of Pediatric Endocrine Pathology VP Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism; 226 children with short stature were enrolled in the study. When conducting the research, general clinical, hormonal and biochemical methods were used: determination of thyroid-stimulating hormone TSH, free thyroxine, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), basal and stimulated GH levels, vit D content, ghrelin (Ghr), parathyroid hormone, vitamin D-binding protein (VD-BP), biochemical blood analysis; molecular genetics methods; instrumental; statistical research methods. In patients with GHD, a positive correlation between the 25(OH)D plasma levels and IGF-1 level was shown, an inverse relationship between vit D and BA was established, as well as direct correlations between IGF-1 level, stimulated GH level, PTH level and BA. It was established that reduced IGF-1 levels, basal and stimulated GH levels and hypovitaminosis D associated with normal levels of Ghr, PTH and increased indicators of VD-BP in the majority of patients with GHD. Ghr level has an inverse correlation with VD-BP and directly correlates with the basal and stimulated levels of GH and IGF-1 level. It was found that most GHD patients with the BsmI polymorphism and COLIA1 have the G allele. With the BsmI polymorphism, 53,57% of the examinees were carriers of the GA genotype, and 25% of the GG genotype; with COLІA1 - carriers of the GG genotype were 53,57%, GT genotype – 39,29% of individuals. The ApaI polymorphism was dominated by the AC genotype. Medium strength between TS TaqI genotype and the low plasma level of 25(OH)D was established. The presence of the AC ApaI genotype increases the chances of hypovitaminosis D by 8,43 times. It was determined that BsmI and ApaI polymorphisms of the VDR gene are significant clinical and diagnostic factors for risk assessing of developing GHD. Presence of G allele BsmI and allele A ApaI is reliably associated with a high risk of developing GH deficiency, both with homo- and heterozygous genotypes. The presence of homozygous genotype AA BsmI VDR and homozygous genotype CC ApaI VDR can be considered as protective polymorphisms for GHD. It has been established that the vit D supplementation leads to an increase in the effectiveness of treatment with rhGH. Vit D supplementation to the treatment regimen inhibits the growth rate decrease that occurs after the first year of monotherapy with rhGH, and thereafter the growth velocity remains stable and acceptable for achieving satisfactory growth rates. The scientific novelty of the study is that, for the first time, a comprehensive study of the GH/IGF-1 axis status was conducted in prepubertal GHD children in conditions of different supply of vit D. The indicators of the growth factor - ghrelin - in prepubertal GHD children were studied. For the first time in Ukraine, a study of the genotypic characteristics of GHD children was conducted, namely the study of the distribution of allele frequencies and genotypes of the polymorphic loci BsmI, TaqI, ApaI of the vit D receptor gene and polymorphism of the type 1 collagen gene COLІA1. Presence of G BsmI and allele A ApaI is reliably associated with a high risk of developing GHD, both with homo- and heterozygous genotypes. The presence of homozygous genotype AA BsmI VDR and homozygous genotype CC ApaI VDR can be considered as protective polymorphisms for the development GHD. For the first time in Ukraine, the advisability and effectiveness of vit D supplementation in complex therapy with rhGH was determined. The inclusion of vit D in the complex therapy of such patients leads to a reliably increase in growth velocity. The practical significance of the obtained results is as follows:A significant vit D imbalance has been established in the majority of GHD children, regardless of the form of the disease, which implies a mandatory study of the vit D content before and during the use of rhGH in children with this pathology, as well as the normalization of its level before the start of rhGH therapy.It has established that due to the obvious decrease in the efficacy of rhGH therapy after the first years of treatment, it is recommended to use combined therapy of GHD children with rhGH and vit D. It was established that the carrier of the allele G BsmI VDR, and the carrier of the allele A ApaI VDR is reliably associated with the risk of GH development, which can be an additional diagnostic test. Keywords: vitamin D, vitamin D receptor gene polymorphism, growth hormone, insulin-like growth factor-1, ghrelin, parathyroid hormone, vitamin D-binding protein, growth hormone deficiency, recombinant human growth hormone children, adolescents, treatment.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу кріоконсервованих мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (ММСК) щурів отриманих із різних джерел (жирова та хрящова тканини) за умов локального та системного введення на динаміку перебігу експериментального артриту. Проблема терапії ревматологічних захворювань актуальна у всьому світі. За даними ВООЗ, у розвинених країнах світу запальні захворювання суглобів і сполучної тканини займають друге місце після серцево-судинної патології серед причин, що призводять до інвалідизації та смертності хворих. Артрит характеризується хронічним запальним сіновіітом та прогресуючим руйнуванням суглобів, що призводить до важкого захворювання та інвалідизації. Існує безліч етіологічних факторів розвитку РА, що стосується терапії цієї патології, то останнім часом все більше звертається увага на можливості і ефективності застосування мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (ММСК). Об’єкт дослідження – перебіг патологічних змін у системі гомеостазу та гомілкових суглобах щурів на тлі експериментального артриту, а саме адьювантного артриту (АА).Предмет дослідження – біологічні властивості кріоконсервованих мультипатентних мезенхімальних сторомальних клітин отриманих з жирової та хрящової тканин. Завдання роботи: Дослідити вплив кріоконсервування на фенотип і функціональні властивості ММСК з жирової та хрящової тканин. Визначити строки розвитку АА у щурів (гострої та хронічної фази) на основі дослідження динаміки дегенеративних змін в хрящовій тканині та показників маркерів запалення в крові щурів. Оцінити вплив ММСК на стан хрящової тканини у щурів з АА. Визначити роль ММСК із різних джерел в корекції деяких показників клітинного імунітету у щурів з АА. Оцінити вплив КрММСК із різних джерел на динаміку зміни маркерів запалення в крові щурів з АА. Матеріали та методи: патофізіологiчний, кріобіологічні, цитофлюориметричний та морфометричний, гістологічний та морфометричний, iмуногістохімічний, імуноцитофлюориметричні, біохімічні, методи статистичної обробки отриманих результатів. У дисертаційній роботi представлено теоретичне узагальнення та нове експериментальне вирішення наукового завдання, спрямованого на корекцію наслідків артриту та активацію процесів, які сприяють відновленню системи гомеостазу та структурно-функціональних властивостей ушкодженого суглобового хряща за рахунок локальногого та системного введення кріоконсервованих ММСК, отриманих з жирової та хрящової тканин. Отримані в роботі результати можуть бути використані для обґрунтування та розробки методів лікування артриту у клінічній практиці.^UThe thesis is devoted to the investigation of the influence of cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) of rats obtained from different sources (fat and cartilage tissues) under local and systemic administration on the dynamics of the experimental arthritis course. The task of therapy of rheumatological diseases is relevant worldwide. According to the WHO, in the developed countries of the world, inflammatory diseases of the joints and connective tissue take the second place after cardiovascular pathology among the causes that lead to disability and death of patients. Arthritis is characterized by chronic inflammatory synovitis and progressive joint destruction, leading to severe disease and disability. There are many etiological factors for the RA development, as for this pathology therapy, recently more and more attention has been paid to the possibilities and effectiveness of the use of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs).The research object was the course of pathological changes in the homeostasis system and ankle joints of rats on the background of experimental arthritis, namely adjuvant arthritis (AA). The research subject was the biological properties of cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells obtained from adipose and cartilage tissues.The research task was as follows: to investigate the effect of cryopreservation on the phenotype and functional properties of MMSCs derived from adipose and cartilage tissues; to determine the timing of the development of AA in rats (acute and chronic phases) based on the study of the dynamics of degenerative changes in cartilage tissue and indices of inflammatory markers in the blood of rats; to evaluate the effect of MMSCs on the state of cartilage tissue in rats with AA; to determine the role of MMSCs from different sources in correcting some indices of cell immunity in the rats with AA; to assess the influence of CrMMSCs from different sources on the dynamics of changes in inflammatory markers in the blood of the rats with AA. Materials and methods: pathophysiological, cryobiological, cytofluorimetric and morphometric, histological and morphometric, immune histochemical, immune cytofluorimetric, biochemical, methods of statistical processing of the obtained results. The dissertation presents a theoretical generalization and a new experimental solution to a scientific task aimed at correcting the consequences of arthritis and activating the processes that contribute to the restoration of the homeostasis system as well as the structural and functional properties of damaged articular cartilage due to the local and systemic administration of cryopreserved MMSCs obtained from adipose and cartilage tissues . The research findings can be used to justify and develop the methods of treatment of arthritis in clinical practice.

Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей впливу кріоконсервування за різними режимами на структурні і функціональні характеристики мононуклеарів (МНК) кісткового мозку та дендритних клітин (ДК) отриманих з них in vitro.Суттєва увага в роботі приділяється оцінці толерогенного потенціалу отриманих з кріоконсервованих МНК ДК, а саме, здатності мінімізувати прояви у мишей ад’ювантного артриту (АА) як експериментальної моделі ревматоїдного артриту (РА) у людини.В роботі було використано наступні сучасні методи досліджень: кріоконсервування, культивування in vitro, проточна цитофлуориметрія, ПЛР в реальному часі, імуномагнітне сортування клітин, інвертована та світлова мікроскопія.Відпрацьовано метод виділення з кісткового мозку мишей СВА/Н 20-тижневого віку МНК у градієнті тразографу, який дозволяє отримати більш ніж 40 % клітин, серед яких 12 % становили CD14+-моноцити – попередники ДК. Визначені умови отримання з МНК кісткового мозку ДК з толерогенними властивостями методом культивування in vitro в присутності ГМ-КСФ (20 нг/мл), IЛ-4 (5 нг/мл) та дексаметозону (0,4 мкг/мл). Це дозволило одержати 96% клітин – кандидатів у ДК з високим рівнем життєздатності (92%).Для підтвердження незрілого толерогенного фенотипу ДК, отриманих в культурі, було підібрано панель маркерів для цитофлуориментричного аналізу. Встановлено, що диференціювання моноцитів у незрілі ДК супроводжується появою характерного для цих клітин маркера – CD11b, втратою CD14-антигена і мінімізацією рівня експресії костимуляторних молекул СD80, СD86.Продемонстровано, що важливою складовою патогенезу АА є дисрегуляція функції імунної системи на тлі розбалансування цитокінового профілю з переважним зростанням вмісту прозапальних цитокінів (ІЛ-6, ФНП-α, ІФН-γ) і дисфункції Т- регуляторної (Трег) ланки імунітету. Такі зміни супроводжувались підвищенням клініко-лабораторних показників: рівня сіалових кіслот, серомукоїдів, та індексу артриту (ІА). Вивчено вплив різних режимів (Р) кріоконсервування під захистом 10% ДМСО з повільною швидкістю охолодження: 1 град /хв до – 80ºС (Р1); до – 40ºС (Р2); до – 25ºС (Р3) з наступним зануренням у кожному випадку у рідкий азот (-196 ºС) на структурні та функціональні властивості МНК кісткового мозку. Показано, що змінюючи умови кріоконсервування можна збільшити толерогенний потенціал отриманих для імунотерапії ДК.Вперше доведено, що кріоконсервування МНК за розробленим режимом (Р2) у порівнянні із загальноприйнятим (Р1) забезпечував максимальні показники їх життєздатності, метаболічної активності, та вмісту CD14+ - попередників ДК, разом з високою експресією білків теплового шоку Нsp70 – індукторів їх толерогенної активності. Оцінка функціонального потенціалу ДК отриманих in vitro з кріоконсервованих МНК за Р2 продемонструвала більш високу їхтолерогенну активность. Підтверджено, що підвищення вмісту Hsp70 в них сприяло збільшенню формування Т-регуляторних клітин (CD4+CD25+ та FOXP3+) і їх функіонального потенціалу за рахунок активації гена foxp3. Це призводило до зниження клінічної маніфестації аутоімунної патології у тварин. Встановлено пролонгований ефект імунотерапії дендритними клітинами, отриманими з кріоконсервованих за Р2 МНК. Аналіз вмісту CD4+CD25+- та FOXP3+-клітин, рівня експресії гена foxp3 і ІА на 7 і 14 добу після застосування різного виду толДК показав, що покращення клінічного статусу тварин з АА більшою мірою корелює з вмістом FOXP3+ Т-регулятрних клітин, ніж рівнем експресії гена foxp3.Продемонстрована здатність толДК отриманих з кріоконсервованих МНК корегувати порушений цитокіновий профіль з переважним стимулюванням продукції протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10) і нормалізацією клінічного стану тварин з АА. Зіставлення ступеня інгібіції прозапальних і стимуляції протизапальних цитокінів після різного виду толДК-терапії свідчить про їхню здатність реалізувати різноспрямовану і з різним ступенем активність по відношенню до цих цитокінів.Вперше встановлені переваги ДК з кріоконсервованих попередників, особливо за режимом 2 в прояві імунокорегуючої дії в порівнянні з ДК отриманими з нативних МНК.Отримані в роботі результати можуть бути використані лікарями-клініцистами які опановують і впроваджують методи клітинно-тканинної терапії в практику лікування АІЗ, в тому числі РА. Представлений матеріал демонструє можливістьвикористання ультранизьких температур як «інструмента», що здатний спрямовано керувати толерогенним потенціалом ДК, отриманих з клітин-попередників.^UThe dissertation is devoted to the study of the features of the cryopreservation effect under different regimes on the structural and functional characteristics of bone marrow mononuclear cells (MNC) and dendritic cells (DC) obtained from them in vitro. Considerable attention is paid to the assessment of the tolerogenic potential of DCs obtained from cryopreserved MNCs, namely, the ability to minimize the manifestations of adjuvant arthritis (AA) in mice as an experimental model of rheumatoid arthritis (RA) in humans. The following modern research methods were used in the work: cryopreservation, in vitro cultivation, flow cytofluorimetry, real-time PCR, immunomagnetic cell sorting, inverted and light microscopy. A method of isolating MNCs from the bone marrow of 20-week-old SBA/H mice in a trasograph gradient was developed, which allows obtaining more than 40% of cells, among which 12% were CD14+ monocytes - DC precursors.It was established that the differentiation of monocytes into immature DCs is accompanied by the appearance of a marker characteristic for these cells - CD11b, the loss of the CD14 antigen and the minimization of the level of expression of costimulatory molecules CD80, CD86. It has been demonstrated that an important component of the pathogenesis of AA is the dysregulation of the function of the immune system (IS) against the background of an imbalance of the cytokine profile with a predominant increase in the content of pro-inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ) and dysfunction of the T-regulatory (Treg) link of immunity. Such changes were accompanied by an increase in clinical and laboratory indicators: the level of sialic acids, seromucoids, and the index of arthritis (IA).The influence of different modes (P) of cryopreservation under the protection of 10% DMSO with a slow cooling rate was studied: 1 degree / min to - 80ºС (P1); up to - 40ºС (P2); to -25ºС (P3) followed by immersion in liquid nitrogen (-196ºС) in each case for the structural and functional properties of bone marrow MNC. It is shown that changing the conditions of cryopreservation can increase the tolerogenic potential of DCs obtained for immunotherapy.

Дисертація присвячена встановленню клініко-фармакологічного значення особливостей цитохрому-Р4503А4 у хворих на туберкульоз (ТБ) легень для ефективності і безпечності фармакотерапії, що має підвищити якість лікування хворих на туберкульоз легень. Встановлено, що у хворих на ТБ з генотипом *AG згідно локусу CYP3A4*1В спостерігається вищий ризик розвитку субтерапевтичної концентрації рифампіцину в крові хворих під час лікування, гірша ефективність протитуберкульозної терапії, і водночас менша активність аланінамінотрансферази (АлТ) і аспартатамінотрансферази (АсТ), ніж у пацієнтів з генотипом *AА. У хворих на ТБ легень з генотипом *1G/1G локусу CYP3А4*1G під час протитуберкульозної терапії активність АлТ і АсТ зросла на 72,7% (P=0,033) і 115,8% (P=0,049) відповідно, водночас у носіїв генотипу *1/1 активність маркери АлТ і АсТ практично не змінились. Таким чином, на початку протитуберкульозної хіміотерапії доцільно визначати у хворих на ТБ легень генотип CYP3A4*1В і CYP3А4*1G, що дозволить виділити групи хворих, які мають вищий ризик розвитку гепатотоксичності і низької ефективності лікування.^UThe dissertation is dedicated for revealing of the clinical pharmacological impact of cytochrome-P4503A4 peculiarities in patients with pulmonary tuberculosis (TB) for the effectiveness and safety of pharmacotherapy. It was established that TB patients with the *AG genotype according to the CYP3A4*1B locus have a higher risk of developing a subtherapeutic serum rifampicin concentration, a worse effectiveness of anti-tuberculosis therapy, and lower activity of ALT and AST than in patients with genotype *AA. In patients with pulmonary TB with *1G/1G genotype of CYP3A4*1G locus during anti-tuberculosis therapy, the activity of ALT and AST increased by 72.7% (P=0.033) and by 115.8% (P=0.049), respectively, while in *1/1 carriers the activity of ALT and AST almost did not change. It is recommended to determine the CYP3A4*1B and CYP3A4*1G genotypes in patients with pulmonary TB, which will allow to identify groups of the patients with higher risk of hepatotoxicity and lower treatment efficiency.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню поліморфізму локусів толл-подібного рецептора 1 (TLR1); толл-подібного рецептора 4 (TLR4); мембранного білка А1 (SLC11A1), фактора некрозу пухлини α (TNFα), манозозв’язувального лектину 1 (MBL1) і гамма-рецептора інтерферону 2 (IFNGR2) та аналізу параметрів продуктивності корів вітчизняної селекції порід українська чорно-ряба молочна та українська червоно-ряба молочна за виявленими поліморфними локусами для збереження генофонду даних порід і підвищення їх продуктивності за рахунок використання перспективних ДНК-маркерів із господарсько цінними ознаками. За результатами проведених досліджень вперше проаналізовано та встановлено особливості генетичної структури дослідних популяцій корів української чорно-рябої та червоно-рябої молочних порід за маркерними мутаціями 1596G>A у першому екзоні гена TLR1; 8732G>A, 8834G>C та 2021C>T в третьому екзоні TLR4; 7400C>G, 7808A>T в одинадцятому екзоні SLC11A1; -824A>G у промоторному фрагменті гена TNFα; 2651G>A у другому екзоні MBL1 і 1008А>G у сьомому екзоні IFNGR2. В української чорнорябої та червоно-рябої молочних порід виявлено три можливі генотипи. Частоти генотипів AA, AG та GG української чорно-рябої породи становлять відповідно 0,12; 0,64; 0,24; червоно-рябої молочної – 0,13; 0,54; 0,33. Частоти алелів А і G складають: в чорно-рябої породи – 0,44 і 0,56; в червоно-рябої – 0,40 та 0,60 відповідно. Встановлено, що ген TLR4 є мономорфним за трьома маркерними мутаціями (8732G>A, 8834G>C, 2021C>T) у третьому екзоні в популяціях всіх досліджуваних порід корів. За MspI-поліморфізмом (8732G>A) виявлено особин двох дослідних популяцій тільки з генотипом ВВ; за RsaIполіморфізмом (8834G>C) – виключно особин з генотипом GG; за BsiHKAIполіморфізмом (2021C>T) – лише корів з гомозиготним генотипом СС. У української чорно-рябої і червоно-рябої порід домінуючим генотипом є СС з відповідними частотами для кожної з них – 0,66; 0,57. Найбільш розповсюджений алель у всіх порід – С (0,83-0,79). Для чорно-рябої та червоно-рябої молочних порід спостерігається виражена перевага за частотами генотипів АА, які становлять, відповідно 0,68 та 0,83. При дослідженні особливостей розподілу гаплотипів у гені мембранного білка А1 (SLC11A1) в дослідних популяціях виявлено гаплотипи CC-АА, CG-AT, CG-AA, CG-ТТ. За встановленим поліморфізмом локусу фактора некрозу пухлини α замутацією -824A>G показано суттєві відмінності частот генотипів та алелів між дослідними популяціями корів. В української чорно-рябої породи частоти гомозиготних генотипів виявились на досить низькому рівні та з однаковими показниками (АА = GG = 0,8), тоді як в української червонорябої частота генотипу GG в 3,5 рази вища порівняно з генотипом АА. Частоти алелів А і G складають: в української чорно-рябої породи – 0,5 і 0,5; в червоно-рябої – 0,39 і 0,61 відповідно. В результаті проведеного дослідження виявлено, що ген манозозв'язувального лектину є поліморфним за маркерною мутацією 2651G>A у другому екзоні в обох досліджуваних популяціях. Визначено частоти генотипів AA, AG і GG в чорно-рябої породи – 0,35; 0,57 і 0,08; та в червоно-рябої – 0,13; 0,76 і 0,11 відповідно. Дослідження генетичної структури популяцій української чорно-рябої та червоно-рябої порід за мутацією 1008А>G у сьомому екзоні локусу інтерферону гамма-рецептора 2 свідчать про схожу тенденцію розподілу частот генотипів і алелів між дослідними групами тварин. За результатами проведеного порівняльного аналізу генетикопопуляційних показників двох дослідних популяцій української чорно-рябої та червоно-рябої молочних порід за п'ятьма генами (TLR1, SLC11A1, TNFα, MBL1, IFNGR2) визначено, що профілі розподілу генотипів в обох порід корів за дослідними об'єктами досить схожі. Переважаючі генотипи в української чорно-рябої породи: АG (0,64) за мутацією 1596G>A (TLR1), CC (0,66) – за 7400C>G (SLC11A1), АА (0,68) – за 7808A>T (SLC11A1); АG (0,66) – за мутацією -824A>G (TNFα); АG (0,57) – за мутацією 2651G>A (MBL1); АG (0,51) – за 1008А>G (IFNGR2). Найвищу частоту мають алелі: G (0,56) за мутацією 1596G>A (TLR1), С (0,83) – за 7400C>G (SLC11A1), А (0,84) – за 7808A>T (SLC11A1), А (0,64) – за 2651G>A (MBL1) і А (0,63) – за 1008А>G (IFNGR2). Проведено аналіз параметрів продуктивності дослідних популяцій корів з різними генотипами за локусами TLR1, SLC11A1, TNFα, MBL1 та IFNGR2. Перспективними у напрямку підвищення молочної продуктивності є наступні комплексні генотипи: LC11A1(СG)SLC11A1(АА), ТNFα(AG), ІFNGR2(АG) (українська червоноряба молочна); TNFα(AА) та ІFNGR2(GG) (українська чорно-ряба молочна).^UThe dissertation work presents the results of investigations on toll-like receptor 1 (TLR1), toll-like receptor 4 (TLR4), membrane protein А1 (SLC11A1), tumor necrosis factor α (TNFα), mannose-binding lectin 1 (MBL1) and interferon gamma receptor 2 (IFNGR2) loci polymorphism and the analysis of productivity parameters of Ukrainian selection breeds of Ukrainian Black-and-White and Ukrainian Red-and-White dairy breeds according to the identified polymorphic loci to preserve the gene pool of these breeds and increase its productivity due to the use of promising PCR-RFLR-markers of economically valuable traits of local cattle breeds. According to the results of the researches, for the first time, the genetic structure of the experimental cattle populations of Ukrainian Black-and-White and Ukrainian Red-and-White dairy breeds was estimated by marker mutations 1596G>A in the first exon of the TLR1 gene; 8732G>A, 8834G>C and 2021C>T in the third exon of the TLR4; 7400C>G, 7808A>T in the eleventh exon of the SLC11A1; -824A>G in the promoter fragment of the TNFα gene; 2651G>A in the second exon of the MBL1 and 1008A>G in the seventh exon of the IFNGR2. Three possible genotypes are found in Ukrainian Black-and-White and Ukrainian Red-and-White dairy breeds. In Ukrainian Black-and-White breed, frequencies of AA, AG, and GG genotypes are 0,12; 0,64; 0,24 respectively; in Ukrainian Red-and-White – 0,13; 0,54; 0,33. The frequencies of A and G alleles are: in Black-and-White breed – 0,44 and 0,56; in Red-and-White – 0,40 and 0,60 respectively. The results of the study demonstrated that in all the experimental populations, the locus TLR4 by mutations 8732G>A, 8834G>C, and 2021C>T in the third exon was monomorphic. For the MspI polymorphism by 8732G>A mutation, only individuals with genotype BB were found; by 8834G>C (RsaI polymorphism) – with genotype GG; by 2021C>T (BsiHKAI polymorphism) – with genotype CC. In Ukrainian Black-and-White and Ukrainian Red-and-White dairy breeds the predominant genotype is СС with the corresponding frequencies for each of them – 0,66; 0,57. The most common allele in all cattle breeds is C (0,83-0,79). In both experimental populations of cows, the most common are AA genotype, which frequencies are 0,68 and 0,83 respectively. During the investigation of the haplotype distribution features in the membrane protein A1 gene (SLC11A1) in experimental populations CC-AA, CGAT, CG-AA, CG-TT haplotypes were revealed. According to results of the polymorphism of the tumor necrosis factor α locus by -824A>G mutation, significant differences between experimental populations of cows in the genotypes and alleles frequencies revealed. It was determined that, in Black-and-White breed the frequencies of homozygous genotypes are found at a fairly low level and with the same indicators (AA = GG = 0,17), while in Red-and-White dairy breed, the frequency of the genotype GG is 3,5 times higher compared to the genotype AA. The frequencies of alleles A and G are: in Black-and-White breed – 0,5 and 0,5; in Red-and-White – 0,39 and 0,61 respectively. The results of the study demonstrated that in both the experimental populations, the mannose-binding lectin gene by mutation 2651G>A in the second exon is polymorphic. Frequencies of AA, AG and GG genotypes were determined in Black-and-White breed – 0,35; 0,57 and 0,08; and in Red-and-White breed – 0,13; 0,76 and 0,11 respectively. The study of genetic structure of the populations of Ukrainian Black-andWhite and Red-and-White dairy breeds by 1008A>G mutation in the seventh exon of the interferon gamma-receptor 2 locus indicate a similar trend in the distribution of genotype and allele frequencies between experimental groups of animals. According to the results of conducted comparative analysis of populationgenetic parameters of two experimental populations of Ukrainian Black-and-White and Red-and-White dairy breeds on five genes (TLR1, SLC11A1, TNFα, MBL1, IFNGR2), it was determined that significant differences between the experimental groups of cows are not observed. Predominant genotypes in Ukrainian Black-nd-White breed are: АG (0,64) by mutation 1596G>A (TLR1), CC (0,66) – by 7400C>G (SLC11A1), AA (0,68) – by 7808A>T (SLC11A1); AG (0,66) – by mutation -824A>G (TNFα); AG (0,57) – by mutation 2651G>A (MBL1); АG (0,51) – by 1008А>G (IFNGR2). Alleles are characterized by the highest frequencies: G (0,56) by mutation 1596G>A (TLR1), C (0,83) by 7400C>G (SLC11A1), A (0,84) by 7808A>T (SLC11A1), A (0,64) – by 2651G>A (MBL1) and A (0,63) – by 1008A>G (IFNGR2). The analysis of productivity traits of experimental cattle populations with different genotypes by TLR1, SLC11A1, TNFα, MBL1 and IFNGR2 loci was conducted. Promising in the direction of increasing milk productivity are TNFα(AА) and ІFNGR2(GG) for Ukrainian Black-and-White breed; SLC11A1СGSLC11A1АА, ТNFα(AG), ІFNGR2(АG) – for Ukrainian Redand-White dairy breed.

Яринка Д.В. Оптичні біосенсорні системи на основі полімерів-біоміметиків та смартфонів для виявлення харчових мікотоксинів: афлатоксину В1 та зеараленону. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.Дисертація на здобуття наукового ступеню доктора філософії за спеціальністю 091 Біологія. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2023. Щорічно у світі виявляють понаднормові рівні забруднення харчових продуктів мікотоксинами. Крім значних економічних збитків, пов’язаних з втратою врожаю (щорічно через забруднення мікотоксинами втрачається до 25% врожаїв зернових), мікотоксини небезпечні для здоров’я людей та тварин. Згідно з даними Продовольчої та сільськогосподарської організації ООН (FAO) до найнебезпечніших мікотоксинів належать, серед інших, афлатоксин В1 (АФВ1) та зеараленон (ЗОН). Тому, розробка нових підходів для моніторингу та контролю цих мікотоксинів в продуктах харчування – дуже актуальна. Зважаючи на це, мета дисертаційної роботи – створення оптичних біосенсорних систем на основі смартфонів та полімерів-біоміметиків у формі молекулярно-імпринтованих полімерних мембран для виявлення поширених харчових токсинів (афлатоксину В1 та зеараленону) у продуктах харчування та тваринних кормах. Полімери-біоміметики у формі молекулярно-імпринтованих полімерних (МІП) мембран запропоновано використати як чутливі елементи біосенсорних систем для визначення АФВ1 та ЗОН. Присутній у аналізованому зразку токсин, який зв’язався з поверхнею МІП мембрани за рахунок утворених в її структурі селективних рецепторних сайтів, можна виявляти після опромінення мембран ультрафіолетовим світлом з певною довжиною хвилі. Це, у свою чергу, ініціюватиме природну флуоресценцію мікотоксинів, інтенсивність якої буде пропорційною концентрації токсинів у зразку. Флуоресцентні біосенсорні сигнали, які генеруються полімерами-біоміметиками у формі мембран, можна реєструвати як за допомогою стандартного лабораторного спектрофлуориметра, так і за допомогою камери смартфона з подальшим аналізом за використання комерційно-доступних програм аналізу цифрових зображень (зокрема програми Spotxel® Reader, 2.1.5 для операційної системи Android 6+). Використання смартфона у ролі реєстратора та аналізатора оптичних сенсорних сигналів дозволить скоротити та спростити процедуру визначення аналіту та може успішно замінити високовартісне лабораторне обладнання. На першому етапі роботи, було синтезовано високостабільні чутливі елементи майбутніх біосенсорних систем на основі МІП мембран, які було отримано методом радикальної полімеризації in situ, з штучними рецепторними сайтами розпізнавання АФВ1 та ЗОН в їхній структурі та оптимізовано їхній склад. Найкраще розпізнавання АФВ1 виявляли для МІП мембран, синтезованих з використанням акриламіду (АА) як функціонального мономеру, з мономерної суміші із співвідношенням псевдоматриця : АА 1:2. Встановлено, що МІП мембрани, синтезовані із використанням функціональних мономерів 1-аллілпіперазину (1-АЛП) та етиленглікольметакритфосфату (ЕГМФ), з мономерної суміші із співвідношенням псевдоматриця : ФМ 1:4 та 1:2, відповідно, демонстрували найкращі розпізнавальні властивості щодо ЗОН. Крім того, було досліджено вплив складу аналізованого розчину на здатність синтезованих МІП мембран розпізнавати цільові мікотоксини та визначено оптимальні умови зв’язування аналітів з мікотоксин-селективними рецепторними сайтами. Вперше створено лабораторні прототипи оптичних біосенсорних систем на основі полімерів-біоміметиків та смартфонів для визначення мікотоксинів та досліджено їхні робочі характеристики. Крім того, розроблено підходи до покращення робочих характеристик створених біосенсорних систем для високочутливого визначення згаданих мікотоксинів за рахунок використання флуоресцентного маркеру у конкурентному варіанті аналізу, а також наночастинок срібла та явища плазмонного підсилення флуоресценції. Розроблені в дисертаційній роботі прототипи біосенсорних систем були успішно апробовані для визначення АФВ1 та ЗОН у реальних зразках пшеничного, кукурудзяного борошна та мелених зразках зернових культур, спільно з ДП «Укрметртестстандарт» проведено метрологічні дослідження розроблених сенсорних систем та затверджено запропоновані методики визначення мікотоксинів.^UYarynka D.V. Optical biosensor systems based on biomimetic polymers and smartphones for food mycotoxins (aflatoxin B1 and zearalenone) detection. – The manuscript. A dissertation submitted in fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (091 Biology). – Institute of Molecular Biology and Genetics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2023. Annually excessive levels of mycotoxins in food products are detected worldwide. In addition to the significant economic losses associated with crop loss (about 25% of food products are lost every year due to mycotoxins contamination), mycotoxins are dangerous for human and animal health. According to the Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO), the most dangerous mycotoxins are, among others, aflatoxin B1 (AFB1) and zearalenone (ZON). Therefore, developing new approaches for monitoring and controlling these mycotoxins in food products is very important. Thus, the dissertation aims to create optical biosensor systems based on smartphones and biomimetic polymers in the form of molecularly imprinted polymer membranes to detect worldwide food toxins (AFB1 and ZON) in food products and animal feed. Biomimetic polymers in the form of molecularly imprinted polymer (MIP) membranes are proposed as sensitive elements of biosensor systems to determine AFB1 and ZON. The toxin from analysed sample, bound with the selective receptor sites formed in the MIPs' structure, can be detected after irradiation of the membranes with ultraviolet (UV) light of a specific wavelength. It will initiate the fluorescence of mycotoxins, the intensity of which will be proportional to the concentration of toxins in the sample. Fluorescent sensor signals generated by the biomimetic polymers in the form of membranes can be registered both with a standard laboratory fluorimeter and with smartphone camera using commercially available digital image analysis programs for smartphones (in particular, the Spotxel program for the Android 6+ operating system) for further analysis. Using a smartphone as an analyser will simplify the analyte determination procedure and can successfully replace expensive laboratory equipment outside laboratories. Thus, this method can be used outside the laboratory.Firstly, highly stable sensitive elements based on MIP membranes with artificial receptor sites for AFB1 and ZON recognition in MIPs’ structure were synthesised by the in situ radical polymerisation method and optimised. The best recognition of AFB1 was found for MIP membranes synthesised using acrylamide (AA) as a functional monomer from a monomer mixture with a 1:2 “dummy” template: AA ratio. It was established that the MIP membranes synthesised using the functional monomers 1-allylpiperazine (1-ALP) and ethylene glycol methacrylate phosphate (EGMF), with 1:4 and 1:2 “dummy” template: functional monomer ratio, respectively, demonstrated the best recognition properties in response to adding ZON. Also, the influence of the analysed sample conditions on the ability of the synthesised MIP membranes to recognise the target mycotoxins was investigated and optimised. For the first time, laboratory prototypes of biosensor systems based on biomimetic polymers and smartphones for the mycotoxins analysis were created, and their analytical characteristics were investigated. In addition, to improve the working characteristics of proposed biosensor systems for highly sensitive mycotoxins analysis, new approaches were developed based on the use of a fluorescent marker in competitive analysis, as well as silver nanoparticles and plasmon-enhanced fluorescence. Prototypes of fluorescent biosensor systems based on smartphones and MIP membranes were successfully tested to determine AFB1 and ZON in wheat and corn real flour samples. In cooperation with the SE “Ukrmetrteststandard” the metrological studies of the developed sensor systems were carried out and the proposed methods for the mycotoxins analysis were approved.