З метою корекції дефіциту фактора або для запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією А проводять замісну терапію, яка полягає у введенні плазмових або рекомбінантних препаратів фактора VIII. Для лікування гемофілії в Україні використовують низку препаратів фактора, як плазмового так і рекомбінантного походження. Залежно від ступеня очищення, відрізняють плазмові препарати проміжного ступеня очищення, одержані за допомогою традиційних методів осадження/адсорбції, та високоочищені препарати, виділені за допомогою методів іонообмінної або афінної хроматографії. З кінця 1980-х років у клінічній практиці почали використовувати рекомбінантні препарати фактора. Вони одержані за допомогою методів генної інженерії з лінії клітин яєчника китайського хом'яка або нирки новонародженого хом'яка. Рекомбінантні фактори поділяють на покоління залежно від вмісту домішкового білка людини чи тварини в кінцевому продукті. Проведено аналіз основних плазмових і рекомбінантних препаратів фактора VIII, зареєстрованих в Україні. Описано їх основні властивості, способи одержання та методи вірусної інактивації. Узагальнено переваги та недоліки плазмових і рекомбінантних препаратів фактора згортання крові.

Синтезовано сорбенти на основі використання макропористих кремнеземних матриць та активних тріазинових барвників як лігандів. Вивчено їх основні фізико-хімічні властивості. На прикладі модельної взаємодії барвників з тромбіном та альбуміном відібрано кращі сорбенти, які можуть бути придатні для виділення та очищення серинових протеїназ трипсинового типу з плазми крові. Вищою специфічністю до тромбіну серед досліджуваних барвників володіють Активний яскраво-голубий КХ, Procion blue НВ та Procion Gelb M-4R.

Технологічні процеси хроматографічного очищення широко використовуються в останні роки для фракціонування плазми крові. Впровадження іонообмінної, афінної та гель-проникної хроматографії сприяли виникненню нового покоління високоочищених та вірус-безпечних терапевтичних препаратів плазми, зокрема факторів зсідання крові. Мета дослідження - дослідити можливість використання методу хроматографічного очищення фактора VIII на кремнеземних сорбентах з тріазиновими барвниками в якості лігандів. Наведено результати досліджень очищення фактора VIII зсідання крові, яке є комбінацією попереднього фракціонування свіжозамороженої плазми з наступним етапом методу афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах. Охарактеризовано основні переваги і недоліки використання тріазинових барвників в ролі афінних лігандів. Запропонований метод охоплює попереднє осадження білків плазми цитратом барію, адсорбцію на гідроксиді алюмінію, відділення осаджених білків центрифугуванням і використання методу негативної афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах: діасорб-активний яскраво-голубий К, діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ, діасорб-Procion Blue HB, діасорб-Procion Gelb MXR. Продемонстровано, що поєднання попереднього фракціонування плазми крові з методом негативної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах із синтетичними барвниками як лігандів надає змогу досягти високого ступеня очищення фактора VIII (приблизно в 100 разів). Наприклад, використання сорбенту діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ збільшує питому активність фактора VIII з 0,017 +- 0,004 МО/мг до 1,940 +- 0,023 МО/мг білка. Наведена технологія може бути застосована одночасно з іншими видами хроматографії у схемі препаративного одержання фактора VIII зсідання крові.

Проблема переробки плазми донорської крові з метою створення ефективних лікарських препаратів є актуальною. На сьогоднішній день створено велику кількість методів фракціонування плазми крові, виділення і очищення її компонентів, зокрема, факторів зсідання крові та фібринолізу. Особливо привабливими з точки зору ефективності є методи біоспецифічної хроматографії. Хроматографічне очищення фактора VIII вважається одним із технологічно найважчих процесів через потенційний ризик його активації та нестабільність за наявності протеаз плазми крові. Для одержання очищених препаратів фактора VIII широко використовують аніонообмінну, гель-проникну й афінну хроматографії. Cинтетичні тріазинові барвники мають низку переваг як ліганди, досліджено можливість використання барвник-лігандної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних носіях для виділення й очищення фактора VIII зсідання крові. Описано сорбцію цього фактора з різними хроматографічними сорбентами та запропоновано спосіб його очищення із кріопреципітату за допомогою методу зв'язування нецільових білків на діасорб амінопропіловому з іммобілізованими тріазиновими барвниками. У результаті проведеної роботи було відібрано групу сорбентів, яка найкраще надається для процесу очищення фактора VIII зсідання крові: діасорб-активний пурпуровий 4ЖТ, діасорб-procion gelb M4R, діасорб-procion blue HB, діасорб-procion blue MXR та діасорб-активний яскраво-голубий К. Очищення фактора VIII відбувалося завдяки явищу негативної афінної хроматографії. Питома активність цього фактора зростала приблизно на порядок.

Процес згортання крові являє собою послідовність хімічних реакцій за участю білків плазми, фосфоліпідів та іонів кальцію. Відсутність будь-якого з цих факторів призводить до виникнення кровотеч. Фактор VIII (FVIII) є одним із факторів згортання крові, а його дефіцит викликає розвиток спадкового захворювання, відомого як гемофілія A. Сучасне лікування гемофілії A полягає у застосуванні препаратів фактора плазмового або рекомбінантного походження. Метa дослідження - розробити технологічну схему одержання препарату FVIII згортання крові у поєднанні класичних методів фракціонування плазми та хроматографії. Фракціонування плазми крові на сьогоднішній день є найбільшим сегментом промислового виготовлення терапевтичних білків. Це зумовило появу нового покоління препаратів, особливо факторів згортання крові. Описано результати очищення FVIII у поєднанні методів преципітації білків (з барій цитратом, ПЕГ-4000 та гідроксидом алюмінію) і двох хроматографічних етапів: іонообмінної на DEAE-SEPHAROSE й афінної на Діасорб-амінопропіловій матриці з тріазиновим барвником Procion Blue HB у ролі ліганда. Показано, що поєднання попереднього фракціонування плазми крові з хроматографічними методами надає змогу досягнути високого рівня очищення (приблизно в 1000 разів, від 0,017 +- 0,004 МО/мг білка до 20,050 +- 0,047 МО/мг білка).

Індекс рубрикатора НБУВ: Р411.023.6-52 + Е70*732.22

Рубрики:

Гемофілія

Біологія людини

Шифр НБУВ: Ж28852/б. Пошук видання у каталогах НБУВ 

Зроблено огляд наукових публікацій, присвячених дослідженню будови, функції та біологічної ролі фактора VIII. Фактор VIII зсідання крові людини (антигемофільний фактор A) є ключовим компонентом системи гемостазу. Роль фактора VIII полягає у підвищенні каталітичної ефективності фактора IXa у процесі активації фактора X. Ген фактора локалізований на довгому плечі X-хромосоми розміром 186 тис пар нуклеотидів, що складається з 26 екзонів, розділених 25 інтронами. Фактор VIII є глікопротеїном з 2332 амінокислотних залишків і має доменну структуру конформації: A1-A2-B-A3-C1-C2. У результаті посттрансляційної модифікації (furin протеази) та під дією протеолітичних ферментів плазми крові цей білок розщеплюється на два ланцюги: важкий 200 кДа (A1-A2-B) і легкий 80 кДа (A3-C1-С2). У плазмі крові людини фактор VIII представлений кількома формами з молекулярними масами 170 - 280 кДа та наявний у концентрації 0,1 - 0,2 мкг/мл. Практично весь фактор у кров'яному руслі є в комплексі з фактором фон Віллебранда, який стабілізує його у кровотоці та є ключовим регулятором активності, оскільки, з одного боку, сприяє його активації тромбіном, а з іншого - запобігає розщепленню молекули фактора протеїназами. Дефіцит фактора VIII, кількісний або якісний, призводить до порушення системи зсідання крові та розвитку захворювання, відомого як гемофілія A, з частотою виникнення 1 на 5000 новонароджених. З метою корекції дефіциту фактора або запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією A проводять замісну терапію, яка полягає у введенні плазмових або рекомбінантних препаратів фактора VIII. Для лікування гемофілії A в Україні використовують зареєстровані препарати факторів зсідання крові як плазмового, так і рекомбінантного походження.

Увагу приділено створенню нового методу отримання очищеного препарату фактора VIII зсідання крові із застосуванням макропористих кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками; синтезу та дослідженню властивостей макропористих кремнеземних сорбентів з іммобілізованими активними барвниками, придатних для очищення фактора VIII зсідання крові; використанню різних хімічних речовин для інактивації вірусів у процесі очищення; розробці схеми отримання високоактивного вірус-безпечного препарату фактора та вивченню його біохімічних властивостей. У результаті досліджень продемонстровано, що процес очищення фактора VIII відбувається завдяки процесу негативної афінної сорбції. Виявлено, що поєднання етапів попереднього фракціонування, іонообмінної та афінної хроматографії забезпечує ступінь очищення в межах 239 - 700 разів, залежно від типу обраного сорбенту.

Індекс рубрикатора НБУВ: Р252.711.3 + Р456.3

Рубрики:

Зміни зсідання крові

Кровотечі . Крововиливи

Шифр НБУВ: Ж28852/б. Пошук видання у каталогах НБУВ